丹参注射液对脑梗死患者自体外周血干细胞旁分泌BDNF的影响1）

赵 宁，杨万章，李 娇，戴 映，杨志刚

正常情况下，外周血中的造血干细胞（PBHSC）数量很少，重组粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF）已经广泛用于PBHSC动员治疗缺血性心脑血管疾病［1］，rhG-CSF本身也可通过抗氧化、抗炎等作用促进神经修复［2］。丹参具有诱导骨髓间充质干细胞转化为神经元样细胞的作用［3］。本研究旨在观察丹参注射液及rhG-CSF治疗前后脑梗死患者外周血BDNF表达的变化。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2009年5月—2012年2月我院住院治疗的年龄40岁～75岁脑梗死恢复期患者60例，符合《各类脑血管疾病诊断要点》和《中风病诊断与疗效评定标准》（试行）诊断标准，平均发病时间15d～64d。按照纳入时间先后随机分为4组，各15例。丹参＋rhG-CSF组15例，男9例，女6例，年龄（51.66±9.43）岁；rhG-CSF组15例，男8例，女7例，年龄（50.60±8.57）岁；丹参组15例，男10例，女5例，年龄（55.0±11.23）岁；常规组15例，男12例，女3例，年龄（55.26±11.68）岁。4组患者性别、年龄、病程、危险因素差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。排除短暂性脑缺血发作、脑出血（经CT诊断）、出血性脑梗死及蛛网膜下腔出血、脑外伤、脑肿瘤、脑寄生虫、代谢障碍引起的偏瘫、风湿性心脏病、冠心病及其他合并房颤所引起的脑栓塞者等。

1.2 方法

1.2.1 试验药物 重组人粒细胞集落刺激因子（商品名：吉粒芬，杭州九源基因工程有限公司，批号：011705）；丹参注射液含生药1.5g／mL（杭州正大青春宝药业有限公司，批号：02011102）。

1.2.2 试验方法 常规组：常规治疗予康复训练，包括偏瘫肢体综合训练、关节松动、运动疗法、手功能训练、言语构音训练、神经肌肉电刺激、日常生活能力训练及针灸等，每天1次，3周为一个疗程。抗血小板聚集药、降压药、降糖药、降脂药等。丹参组：丹参注射液20mL／d静脉输注，连用7d，余治疗同常规组。rhG-CSF组：在抽血检查次日08：00皮下注射吉粒芬300 μg，连用3d，余治疗同常规组。丹参＋rhG-CSF组：第1天开始连续使用丹参注射液20mL／d静脉输注7d，同时在丹参注射液滴注第2天08：00皮下注射rhG-CSF 300μg，连用3d，余治疗同常规组。4组均以7d为1个疗程。

1.2.3 指标检测 4组均在疗程1d～7d次日晨采外周静脉血标本检测，并做临床评定。采用双抗体夹心酶联免疫（ELISA）法。样品稀释：以50μL待测血清样品＋250μL样品稀释液将待测样品稀释5倍。实验过程：加入30μL血清到含120μL酸-乙醇提取液的EP管中；振荡并在室温下摇晃孵育30min；以10 000r／min离心5min，再转移100μL上清液到含200μL三羟甲基氨基甲烷缓冲液 （pH=7.6）的EP管中，充分混匀。加入300μL试验稀释液A，充分混匀，立即检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0软件处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。满足正态性和方差齐性时，各组治疗前后比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

丹参＋rhG-CSF组、rhG-CSF组治疗前后BDNF比较差异有统计学意义（P＜0.05）；与常规组治疗后比较，丹参＋rhGCSF组、rhG-CSF组BDNF差异有统计学意义（P＜0.05）；丹参＋rhG-CSF组与丹参组、常规组治疗前后差值比较差异有统计学意义（P＜0.05）；rhG-CSF组与丹参组、常规组治疗前后差值比较差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 4组治疗前后血清BDNF的变化（x±s） ng／mL

3 讨 论

BDNF是一种中枢神经系统内合成的神经营养因子，对神经元的存活、分化及生长有着重要的作用［4］。BDNF在中枢神经元中可能通过TrkB受体介导细胞外信号调节激酶 （extracellular signal-related kinases，ERKS）and Beta-连环蛋白（B-catenin）磷酸化来促进神经元的成熟及重塑，促进轴突再生［5］。Keng等［6］发现在坐骨神经损伤大鼠中，移植BDNF转染的神经干细胞能明显促进髓鞘形成、组织再生以及血管的发生，促进功能修复。Haiying等［7］运用BDNF基因修饰过的神经干细胞治疗创伤性颅脑损伤大鼠，发现修饰后的干细胞能过度表达BDNFmRNA，移植后细胞存活的数量和比例、突触前及突触后蛋白的表达及神经元标识物Tubulin表达，明显高于未经修饰的干细胞治疗组，同时干细胞本身还分泌几种营养因子，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，BFGF）及胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGFs），其中 VEGF主要是通过诱导内皮细胞表达VEGF同时分泌多种组织蛋白酶，诱导新生血管形成［8］。BFGF能促进中胚层和神经外胚层细胞分裂的多肽，具有强烈的血管生成作用［9］。IGFs是一类多功能细胞增殖调控因子，可促进体外培养的多种细胞增殖［10］，BDNF的表达通过干预PI3K／Akt信号通路［11］调控上述营养因子表达，并有相互影响作用，促进神经修复、血管生成及细胞的增殖［12］。

丹参为唇形科植物，味苦，性微寒，具有活血祛瘀、养血安神、调经止痛、凉血消痈的功效。祖国医学认为“一味丹参，功同四物”。近年来，学者们对丹参作为诱导剂，对干细胞诱导分化为神经元样细胞、心肌细胞等作用做了大量的研究，发现丹参的有效成分在体外实验中其可促进植入的BMSCs向损伤部位定向募集，同时向神经干细胞标志物巢蛋白（Nestin）、神经元标志物丝蛋白（Nerulfilament protein，NF）的方向分化，且分化效率较高［13-15］。陈丽丽等［16］研究发现丹参多酚酸盐可以明显降低急性癫痫痉挛性大鼠的发作等级和发作时间，可能通过BDNF的表达增高来发挥作用。张伟骏等［17］研究发现，活血祛瘀解郁法治疗卒中后抑郁症的大鼠，与模型组相比，给药组大鼠海马表现为BDNF阳性细胞数量明显增多，认为中药活血祛瘀解郁方治疗PSD能增强BDNF的表达，进一步保护受损的5-HT、NE等神经元，促进神经元的再生，增加递质浓度，改善其活性，促进功能恢复，达到改善神经损伤和抗抑郁的作用。李云等［18］发现，脑卒中急性期患者神经功能缺损程度与血清BDNF含量呈负相关。

本研究与上述学者的部分研究结果相似，丹参与rhG-CSF配伍用药组、rhG-CSF单独用药组，均能明显提高BDNF的表达。丹参组及常规组不能明显提高BDNF的表达，考虑可能两组中自体骨髓中的干细胞未经重组粒细胞集落刺激因子动员，外周血中干细胞的数目及浓度偏低，因而相应的分泌脑源性神经生长因子较少有关。rhG-CSF用作自体骨髓干细胞动员剂，它有外源性干细胞无可比拟的优点。近10余年来，该药被扩大用于缺血性心脑血管病，在目前国内外众多的实验与临床研究中，发现该药有神经保护和再生作用，包括修复神经祖细胞，减轻脑水肿，提高生存率，促进感觉和运动功能［19-21］。本研究认为二者配伍使用可能与通过促进中枢神经系统的神经元星形胶质细胞等产生BDNF有关，脑缺血再灌注损伤后级联反应导致自由基、兴奋性氨基酸、ET、iNO等过度产生，二者配伍使用以及rhG-CSF单独使用在一定程度上能抑制此反应，诱导BDNFmRNA、BDNF蛋白上调，并延长其高表达时程，保护并促进内源性神经保护机能。

［1］ Hyun JaeKang，Eun JungYoon，Eun JuLee，et al.Co-treatment with darbepoetin and granulocyte-colony stimulating factor is efficient to recruit pro-angiogenic cell populations in patients with acute myocardial infarction［J］.Cell Transplantation，2012，21（5）：1055-1061.

［2］ Lanfranconi S，Locatelli F，Corti S.Growth factors in ischemic stroke［J］.Cell Mol Med，2011，15（8）：1645-1687.

［3］ 张德凤，潘家华，张梅，等.丹参联合骨髓间充质干细胞移植治疗新生鼠缺氧缺血性脑损伤的实验研究［J］.实用儿科学杂志，2011，26（2）：142-145.

［4］ Chekhonin VP，Lebedev SV，Volkov1AI，et al.Activation of expression of brain-derived neurotrophic factor at the site of implantation of allogenic and xenogeniec neural stem（progenitor）cells in rats with ischemic cortical stroke［J］.Cell Technologies in Biology and Medicine，2011，150（4）：515-518.

［5］ Jung YeonLim，Sang InPark，Seong MukKim，et al.Neural differentiation of brain-derived neurotrophic factor-expressing human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in culture via trkB-mediated ERK and B-catenin phosphorylation and following transplantation into the developing brain［J］.Cell Transplantation，2011，5（4）：1-47.

［6］ Keng YenFu，Lien GuoDai，Ing MingChiu，et al.Sciatic nerve regeneration by microporous nerve conduits seeded with glial cell line-derived neurotrophic factor or brain-derived neurotrophic factor gene transfected neural stem cells［J］.Artificial Organs，2011，35（4）：363-372.

［7］ Ma Haiying，Bo Yu，Li Kong，et al.Neural stem cells over-expressing brain-derived neurotrophic factor（BDNF）stimulate syn-aptic protein expression and promote functional recovery following transplantation in rat model of traumatic brain injury［J］.Neurochem Res，2011，29：137-168.

［8］ Li LQ，Gao JH，Lu F.Experimental study of the effect of adipose stoma vascular fraction cells with VEGF on the revascularization of free fat transplantation［J］.Chin J Plast Surg，2012，28（2）：122-126.

［9］ Guo S，Yu L，Cheng Y.GFRbeta triggered by buff promotes the proliferation，migration of endothelial progenitor cells via p-ERK signaling［J］.Cell Biol Int，2012，36（10）：945-950.

［10］ Jevdjovic T，Maake C，Eppler E，et al.Effects of insulin-like growth factor-1treatment on the endocreas pancreas of hypophysectomized rats：Comparision with growth hormone replacement［J］.Front Neuroendocrinol，2004，151（2）：223-231.

［11］ Zhang I，Liu G，Wu Y，et al.BDNF promotes EGF-induced proliferation and migration of human fetal neural stem／progenitor cells via the PI3K／Akt pathway［J］.Molecules，2011，16（12）：10146-10156.

［12］ Lu P，Jones LL，Snyder EY，et al.Neural stem cells constitutively secrete neurotrophic factors and promote extensive host axonal growth after spinal cord injury［J］.Exp Neurol，2003，181（2）：115-129.

［13］ Tong Yinghui，Wei Xu，Hongcan Han.Tanshinone IIA increases recruitment of bone marrow mesenchymal stem cells to infarct region via up-regulating stromal cell-derived factor-1／CXC chemokine receptor 4axis in a myocardial ischemia model［J］.Phytomedicine，2011，18（6）：443-450.

［14］ Liu YR，Qu SX，Maitz MF，et al.The effect of the major components of salvia miltiorrhiza bunge on bone marrow cells［J］.Ethnopharmacology，2007，111（2）：573-583.

［15］ 余勤，罗依，鄂艳，等.丹参素定向诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究［J］.中国中西医结合杂志，2005，25（1）：49-53.

［16］ 陈丽丽，黄靓妹，詹红艳.丹参多酚酸盐对匹鲁卡品致痫大鼠BDNF表达的影响［J］.中国实验诊断学，2011，15（10）：1629-1631.

［17］ 张伟骏，陈眉，裘涛.活血祛瘀解郁法对卒中后抑郁症大鼠海马基因BDNF表达的研究［J］.中华中医药学刊，2007，25（7）：1410-1411.

［18］ 李云.脑卒中急性期患者神经功能缺损程度与血清BDNF含量的相关性研究［J］.中国实用神经疾病杂志，2011，14（24）：254-255.

［19］ Kai D，Verena Q.Successful regeneration after experimental stroke by granulocyte-colony stimulating factor is not further enhanced by constraint-induced movement therapy either in concurrent or in sequential combination therapy［J］.Stroke，2012，43（1）：185-192.

［20］ 肖广正，孔祥玉，赵淑敏.自体骨髓干细胞动员治疗脑梗死的研究进展［J］.承德医学院学报，2011，28（2）：179-181.

［21］ 杜平，张家伟，王海军.重组人粒细胞集落刺激因子治疗急性脑梗死74例疗效观察［J］.中国康复理论与实践，2010，16（9）：809-810.