以1,4-二甲基咔唑-9-丙酸为荧光衍生化试剂高效液相色谱法测定醇

劳文剑，宋翠华，尤进茂，欧庆瑜

(1.中国科学院 兰州化学物理研究所，甘肃 兰州 730000; 2. 曲阜师范大学 化学与化工学院，山东 曲阜 273165)

醇在饮料、食品、药物和生物体中广泛存在，也广泛用于制药、化妆品和表面活性剂等工业. 甾体、碳水化合物对于生物体有着重要作用，因而它们都是重要的分离分析对象. 脂肪醇、甾体、碳水化合物等没有紫外吸收，用HPLC对它们进行高灵敏的荧光检测一般需经衍生化[1]. 衍生化羟基主要用酰化反应，生成酯、氨基甲酸酯、磺酰酯等[2-7]. 例如，应用2,4,6-三甲苯磺酰氯和2,4,6-三异丙基苯磺酰氯作缩合剂直接用于醇和酸的缩合已有报道，然而由于缩合剂的位阻作用，使反应活性及酰化产率不理想，而且缩合反应必须在较高温度下进行. 应用酸酐进行缩合反应通常须在40～100 ℃下完成，并且在潮湿的环境下酸酐不稳定[8].

本文作者报道以间苯二磺酰氯作缩合剂，利用1,4-二甲基咔唑-9-丙酸与间苯二磺酰氯的混合酸酐用于醇的荧光衍生化. 醇和1,4-二甲基咔唑-9-丙酸荧光试剂反应形成稳定的荧光衍生物. 所用缩合剂间苯二磺酰氯为固体，易称量，潮湿环境下稳定，与2,4,6-三甲苯磺酰氯和2,4,6-三异丙基苯磺酰氯对比，反应时位阻小、活性高，试剂与醇缩合产率高，条件温和不需加热处理[4].

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

HITACHI 655型高效液相色谱仪(日本) ，配备651-10S荧光分光光度计，644-61积分仪、U2型电磁恒温槽.

三乙胺、吡啶(分析纯)和乙腈(分析纯)以5A分子筛干燥，用前经过蒸馏处理. 磷酸二氢铵(分析纯)，购自山东济宁化学试剂公司，C1-C9、C12、C18醇(分析纯)购自山东济宁化学试剂公司，胆固醇购自北京化学试剂公司，其他溶剂皆为分析纯购自济宁化学试剂公司. 1,4-二甲基咔唑-9-丙酸按文献[9]合成，间苯二磺酰氯按文献[4]合成. 1,4-二甲基咔唑-9-丙酸的二氯甲烷溶液为1×10-2mol/L，间苯二磺酰氯的二氯甲烷溶液为1.1×10-2mol/L，4-N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)的乙腈溶液为1.2×10-2mol/L，醇的二氯甲烷溶液为3.0×10-3mol/L.

1.2 色谱条件

色谱柱：200 mm×4.6 mm ID，5 μm Spherisord C18 (大连化学物理研究所). 柱温：室温. 荧光激发和发射狭缝10 nm. 激发和发射波长：λex= 292 nm，λem= 372 nm. 流动相A为体积比30/70的乙腈/水溶液，其中包括20 mmol/L的磷酸二氢铵、18 mmol/L的三乙胺，pH = 6.5，B为体积比95/5的乙腈/水溶液. 分离衍生物的梯度条件为: 0 min, 100% A; 20 min, 30% A; 25 min, 20% A; 30 min, 1% A. 流速：1.0 mL/min.

1.3 优化的醇的衍生化过程

制备混合酸酐：在2 mL二氯甲烷中依次加入5.4 mg (0.02 mmol)1,4-二甲基咔唑-9-丙酸、 6.0 mg (0.022 mmol)间苯二磺酰氯和2.9 mg (0.024 mmol) DMAP，摇匀后，室温下放置30 min. 反应液不经处理可直接进行下一步反应. 在1 mL混合酸酐二氯甲烷溶液中，加入1.8 mg DMAP和1 mL醇的二氯甲烷溶液. 使混合均匀，10 min后取出10 μL反应液，用N2吹干，残余物溶解在100 μL乙腈中，取5 μL进样分析. 衍生化反应式见图1.

图1 混合酸酐衍生化醇的反应式Fig.1 Scheme of mixed acid anhydride to derive alcohol

1.4 血清样品的预处理

在10 mL离心管中加入270 μL血清，依次加入30 μL水和100 μL 0.1 mol/L KOH溶液，在超声波下处理30 s，使酸性化合物转变成相应的盐，加入200 μL二氯甲烷充分混合，室温下放置30 min，移取有机相. 残余物再用200 μL二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷分别以0.1 mol/L HCl和去离子水洗涤以除去游离胺类化合物. 100 μL二氯甲烷萃取物用于衍生化.

2 结果与讨论

2.1 衍生化条件

为了找到最佳的衍生化条件，以正戊醇为对象，研究了不同溶剂、催化剂、反应温度、反应时间等对衍生化效果的影响.

分别以丙酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷、DMF、乙酸乙酯为反应的共溶剂，按实验部分所述的衍生化步骤制备混合酸酐和进行衍生化反应，以二氯甲烷为溶剂的衍生物的荧光强度为100%进行比较，结果是二氯甲烷(100%) > 氯仿(95%) > 乙腈 (32%) > 乙酸乙酯 (25%) > 丙酮 (20%) > DMF (10%). 表明衍生化的溶剂以二氯甲烷为最佳，氯仿次之. 因此，衍生化采用二氯甲烷为溶剂.

实验证明，没有碱催化剂，则衍生化反应不能进行. 对DMAP、吡啶、三乙胺、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶的催化效果进行了考察. 以DMAP为催化剂的衍生物的荧光强度为100%进行比较，结果是DMAP (100%) > 三乙胺(37.5%) > 吡啶(31.5%) > 3-甲基吡啶(25%) > 2-甲基吡啶(6.5%). 可以看出，DMAP的催化效果最好.

在0～40 ℃温度范围内对衍生产率(检测响应)进行了研究，最佳衍生温度为25～30 ℃，低于25 ℃反应速率明显偏低，高于30 ℃反应产率有下降趋势(图2). 衍生化反应时间对产率有影响，衍生化反应的产率在10 min以后就基本稳定(图2). 制备的混合酸酐溶液可密封放置至少一周，其活性不会减小. 为了评价衍生物的稳定性，将所得衍生物每隔6 h分析一次，结果表明衍生物检测响应信号24 h内基本稳定 (图2).

图2 衍生化反应参数对荧光强度的影响Fig.2 Effect of derivatization parameters on fluorescence intensity

2.2 衍生直链脂肪伯醇、二级醇和三级醇

分别对C1-C9的直链脂肪伯醇和C12和C18两个长链脂肪伯醇进行了衍生化实验，取得了较好的效果(图3). C1-C9直链脂肪伯醇的保留时间分别为(min)：C116.882, C218.052, C320.523，C422.338, C524.262, C626.097, C727.885, C829.505, C931.06. C12和C18两个长链脂肪伯醇以及内标正庚醇(C7)的保留时间分别为(min)：C729.863, C1235.027, C1838.254.

分别对异丙醇、异丁醇、叔丁醇、异戊醇和环己醇以及胆固醇进行了衍生化实验，图4中峰的保留时间(min)：1, 异丙醇19.563; 2, 叔丁醇21.06; 3, 异丁醇23.075; 4, 异戊醇24.538; 5,环己醇25.397; 6, 胆固醇 32.475. 结果表明，1,4-二甲基咔唑-9-丙酸和间苯二磺酰氯混合酸酐法对仲醇和叔醇都有衍生化能力，特别是对胆固醇的衍生，用于生物样品是有意义的.

左图：C1-C9醇. 右图：C12，C18醇，正庚醇(C7)为内标图3 直链脂肪伯醇衍生物的色谱图Fig.3 Chromatograms of straight-chain aliphatic primary alcohol derivatives

左图: 1, 异丙醇; 2, 叔丁醇; 3, 异丁醇; 4, 异戊醇; 5, 环己醇. 右图: 6, 胆固醇图4 二级醇和三级醇衍生物的色谱图Fig.4 Chromatograms of secondary and tertiary alcohol derivatives

2.3 线性范围和检测限

配制0.4～1 000 μmol/L的C1-C9醇的系列标准溶液，按实验方法进行衍生然后进行色谱分析，结果表明在此范围内，大部分醇有着良好的线性关系，回归系数大于0.995，相对标准偏差小于5%，线性范围和检测限见表1.

表1 衍生C1-C9直链伯醇的线性范围和检测限Table 1 Linear ranges and detection limits of straight-chain aliphatic primary alcohol (C1-C9) derivatives

2.4 方法应用

对人血清中游离醇的测定结果见表2. 谱图见图5.

表2 血清中游离醇的测定结果Table 2 Determination results of free alcohol in human serum

图中C1：甲醇(16.075min)，C2：乙醇(18.827min)，C3：正丙醇(19.917 min)图5 血清中游离醇的色谱图Fig.5 Chromatograms of free alcohol derivatives in human serum

结论:1,4-二甲基咔唑-9-丙酸与间苯二磺酰氯生成的混合酸酐，能够对十八个碳以下的直链脂肪伯醇、六个碳以下的仲醇和叔丁醇进行衍生，还能够衍生胆固醇. 衍生化反应在室温下即可完成，条件温和，操作简便. 衍生产物在反相液相色谱条件下可获得较理想的分离，适合醇类化合物的分析.

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