塑化剂DEHP与植物雌激素GEN孕期暴露对雄性子代大鼠发育影响

西安交通大学医学院第二附属医院泌尿外科（西安710004）李和程 张连栋 高 明 王 磊 邓 骞 种 铁 王子明

环境内分泌干扰物（Environmental endocrine disruptors，EED）暴露对生态环境和人类健康的影响一直是人们关注的焦点。近20余年来，大量文献报道认为胚胎期或围出生期环境内分泌干扰物暴露是近50余年来男性精子密度下降以及隐睾、尿道下裂和睾丸肿瘤发病率增高的重要原因［1］。具有抗雄激素作用的邻苯二甲酸（2-乙基己基）酯（DEHP）暴露对子代有较为确切的生殖毒性。染料木黄酮（GEN）摄入量与人类精子密度负相关，体外试验证实低剂量GEN可以增强精子顶体反应，对其他环境内分泌干扰物造成的损伤有拮抗作用。本研究通过建立妊娠期大鼠同时暴露于DEHP与GEN动物模型，探讨两者对雄性子代发育是否具有协同亦或是拮抗作用。

材料与方法

1 试剂与仪器 邻苯二甲酸（2-乙基己基）酯购自天津科密欧化学试剂有限公司；染料木黄酮购自西安陕西慧科植物开发公司；Mettler AG285电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；游标卡尺（杭州钱塘江工具量具有限公司）。

2 实验动物处置 健康成年SPF级SD雌性大鼠30只（体重200±20g）和雄性15只（体重300±30g）由西安交通大学动物实验中心提供并饲养，自然昼夜节律采光，室温18～24℃，饲料不含豆类以及苜蓿（Soy-and alfalfa-free diet，SAFD），自由饮用净化水。

3 实验方法 SPF级雌性SD大鼠30只，雄鼠15只，雌性大鼠按2∶1与雄性大鼠同笼交配，次日晨将雌鼠逐一阴道涂片镜检，发现精子当日记为孕期零天（GD0）。发现精子后取出雄鼠，雌鼠每笼一只，将所获30只孕鼠随机分到以下5组，每组6只。A组为对照组，仅灌胃花生油（2ml／kg）；B组为 DEHP（250mg／kg）组；C 组为 DEHP（250mg／kg）+低剂量 GEN（50mg／kg）组；D 组为 DEHP（250mg／kg）+高剂量GEN（400mg／kg）组；E组为高剂量 GEN（400mg／kg）组。在亲代雌鼠的孕3d（GD3）至孕20d（GD20），每天按分组方案灌胃。于出生后第1天（Postnatal day 1，PND1）时，计数各组子代雌雄幼鼠活产只数、雌雄比例，对子代雄鼠称重的称重同时测量肛门生殖器距离（AGD），计算 AGD／体重1／3，并记录母鼠体重变化。

4 统计学处理 全部数据采用统计分析软件SPSS13.0进行处理，计量资料均以均数±标准差（±s）表示，组间比较首先检验资料的正态性和方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD检验法，以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

结 果

1 PND1各组子代大鼠发育情况 见附表。30只雌鼠顺利产仔，PND1各组幼鼠每窝活产只数、雌雄比例无显著性差异。雄性子代大鼠体重C组较A组有显著性降低（P＜0.05），D组较A组有极显著性差异（P＜0.01），D组较B、C、E组均有显著性降低（P＜0.05）。各组AGD／体重1／3无显著性差异（P＞0.05）。

附表 PND1各组子代大鼠指标（±s）

附表 PND1各组子代大鼠指标（±s）

注：＊ 与A组比较，P＜0.05；＊＊ 与A组比较，P＜0.01；＃ 与B组比较，P＜0.05；△ 与C组比较，P＜0.05；■ 与E组比较，P＜0.05

组 别 母鼠只数 平均每窝活产只数 仔鼠只数 出生性别比（雌∶雄）子代雄鼠体重（g）母鼠体重变化GD3-GD21（g）A 6 12.5±1.64 75 0.92∶1 6.60±0.89 110±15.4 B 6 12.33±1.86 74 0.85∶1 6.27±0.81 98±10.1 C 6 13.33±1.75 80 0.91∶1 6.14±0.37＊ 96±6.7 D 6 13.0±1.79 78 1.05∶1 5.24±0.81＃△■＊＊ 101±13.9 E 6 11.67±1.75 70 1.12∶1 6.23±0.72 114±19.3

2 PND1各组子代雄性大鼠AGD／体重1／3见附图。于PND1测量各组子代雄鼠体重及肛门生殖器距离，计算 AGD／体重1／3。各组 AGD／体重1／3无显著性差异（P＞0.05），但D组较对照组有下降趋势。

附图 PND1各组子代雄性大鼠AGD／体重1／3

讨 论

人类及动物发育及成熟的关键时期，一般包括三个阶段：胚胎期及新生儿发育期、青春期前后。胚胎期暴露于内分泌干扰物，由于内分泌干扰物具有可以穿过胎盘的特性（如DEHP等），会对胚胎造成不可逆的损伤，如可以造成雌雄比例改变；性别特征改变，主要表现为AGD及肛门生殖器指数（AGI）减小、乳头保留、尿道下裂、隐睾和附睾发育不全等［2］，而一旦受损则往往会明显影响到以后的解剖结构、生理功能及行为，且很难逆转。

以DEHP为代表的邻苯二甲酸酯类在化学染料、个人护理用品及化妆品（指甲油、防晒霜、发胶、洗发水等）、医疗用品（输液管、输血袋等）中均大量存在，该类物质常被用作聚氯乙烯塑料（PVC）的塑化剂，以增强弹性以及柔韧性。该类物质可通过胎盘屏障进入胎儿体内，并可在出生后经乳汁及婴儿用品进入体内［3，4］。流行病学调查示：脐血MEHP（DEHP代谢产物）水平与怀孕期缩短正相关，间接证据也提示该类物质在围生期发挥抗雄激素作用，同时母亲尿液中DEHP代谢产物的浓度与婴儿睾丸下降不全以及AGD降低正相关［5，6］。DEHP目前受关注最高，每年消耗量约有200万吨以上，已成为全球最广泛的污染物之一。

自2011年5月台湾爆出“塑化剂风波”，该类物质引起广泛关注。

植物性雌激素如染料木黄酮（Genistein，GEN）、黄豆苷元（Daidzein，DAI）等，因在食品中广泛接触，其对雄性生殖系统的影响亦引起广泛的关注。有流行病学研究注意到大豆类食品因其含有的主要组分染料木黄酮，其摄入量增加往往出现精子密度下降，同时导致肛门生殖器距离（Anogenital distance，AGD）缩短，睾酮水平下降以及雄性雌性化等，并呈现剂量-效应关系［7，8］。同时有体外实验证实染料木黄酮低剂量可促进顶体反应以及睾酮分泌，高剂量则是抑制作用［9］。有文献报道低剂量染料木黄酮（2mg／kg BW）对氯氰菊酯（Cypermethrin）所致新西兰大白兔精子质量下降有改善作用。

目前对于环境内分泌干扰物的研究，多集中于单种环境内分泌干扰物不同剂量对雄性生殖系统的影响，包括体外及体内试验。环境内分泌干扰物合用的研究较少。而环境中接触的环境雌激素并非单一，因而对两种或多种环境内分泌干扰物合用的研究亦是该领域的一个重点，可以进一步发现环境内分泌干扰物在合用的情况下是否具有协同，叠加亦或是拮抗作用，从而为孕期暴露对雄性子代的生殖毒性提供实验依据。

本实验较系统地研究了孕期母鼠暴露于单种及两种常见内分泌干扰物（DEHP及GEN）对子代雄鼠近期毒性作用。结果发现：孕期单一暴露于DEHP（250mg／kg）及GEN（400mg／kg）并未造成平均每窝活产只数、仔鼠只数、出生时性别比、子代雄鼠体重、AGD／体重1／3较对照组的显著性变化。说明两者孕期单一暴露对子代发育、性分化等无显著影响。但其远期效应值得进一步观察，特别是成年后生殖系统发育、生精功能及睾酮水平等。近几年的研究证实：隐睾、尿道下裂与AGD减低有相关性［10］；围生期母亲尿液中PAEs代谢物与所生男婴AGD减少有关，从而提示围生期暴露于PAEs有去雄性化效应（Demasculinizing effect）［11］。而AGD／体重1／3作为修正 AGI，可排除体重的影响，具有较高的敏感性，可以更好的反映去雄性化效应。

孕期同时暴露于 DEHP（250mg／kg）及低剂量GEN（50mg／kg），子代雄鼠体重较对照组出现显著下降，但平均每窝活产只数、仔鼠只数、出生时性别比、母鼠孕期体重变化等指标较对照组的并无显著性变化，AGD／体重1／3较对照组也未出现显著性下降。说明在此暴露水平，已对子代雄鼠发育产生一定影响，但其远期效应，包括睾酮水平，成年后生精功能值得进一步观察。

孕期同时暴露于 DEHP（250mg／kg）及高剂量GEN（400mg／kg），平均每窝活产只数、仔鼠只数、出生时性别比等指标较对照组的亦无显著性变化，AGD／体重1／3虽较对照组的亦无显著性变化，但有下降趋势，同时子代雄鼠体重较其余四组出现显著性下降。说明两者孕期同时暴露，对子代雄鼠发育造成较为明显的影响，其效应较 DEHP（250mg／kg）及高剂量GEN（400mg／kg）单一暴露亦出现明显加重的倾向，较DEHP（250mg／kg）与低剂量GEN（50mg／kg）同时暴露更为明显，提示 DEHP（250mg／kg）及高剂量GEN（400mg／kg）同时暴露存在着协同作用，其远期效应如成年后睾丸、附睾、前列腺、精囊腺的发育，睾酮水平及睾酮合成相关基因的表达、睾丸下降情况等值得进一步观察。

本研究完成了不同剂量GEN与DEHP两种环境内分泌干扰物在孕期暴露对雄性子代系统发育方面研究的空白，为下一步的深入研究奠定了基础。同时提示小剂量GEN与DEHP同时暴露，雄性化指标有减弱趋势，大量摄入GEN与DEHP暴露，雄性化指标明显减弱。同时有必要观察其远期效应，进一步明确其生殖毒性，同时有必要从信号转导途径进一步阐明机制。另外，由于种属差异，我们的研究结果仍需要在其他种属动物中进一步重复进而充分得到验证；同时，对于环境内分泌干扰物的流行病学调查有必要深入开展，明确人群中暴露情况及对生殖系统影响。通过孕期暴露于两种常见环境内分泌干扰物的研究，探讨了单种和多种内分泌干扰物暴露所致效应的关系，同时为评估孕期暴露于内分泌干扰物的安全性及风险提供了实验依据，具有一定的理论意义及临床应用前景。

［1］Casals-Casas C，Desvergne B.Endocrine disruptors：from endocrine to metabolic disruption ［J］.Annu Rev Physiol，2011，73（2）：135-162.

［2］Roy J R，Chakraborty S，Chakraborty T R.Estrogen-like endocrine disrupting chemicals affecting puberty in humans-a review ［J］.Med Sci Monit，2009，15（6）：137-145.

［3］Heudorf U， Mersch-Sundermann V，Angerer J.Phthalates：toxicology and exposure［J］.Int J Hyg Environ Health，2007，210（5）：623-634.

［4］Kamrin M A.Phthalate risks，phthalate regulation，and public health：a review［J］.J Toxicol Environ Health B Crit Rev，2009，12（2）：157-174.

［5］Culty M，Thuillier R，Li W，et al.In utero exposure to di-（2-ethylhexyl）phthalate exerts both short-term and long-lasting suppressive effects on testosterone production in the rat［J］.Biol Reprod，2008，78（6）：1018-1028.

［6］Swan S H，Liu F，Hines M，et al.Prenatal phthalate exposure and reduced masculine play in boys［J］.Int J Androl，2010，33（2）：259-269.

［7］Ball E R，Caniglia M K，Wilcox J L，et al.Effects of genistein in the maternal diet on reproductive development and spatial learning in male rats［J］.Horm Behav，2010，57（3）：313-322.

［8］Cederroth C R，Auger J，Zimmermann C，et al.Soy，phyto-oestrogens and male reproductive function：a review ［J］.Int J Androl，2010，33（2）：304-316.

［9］朱锋荣，王勇刚，陈 洁，等.植物雌激素对体外培养的大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的作用［J］.中华男科学杂志，2009，15（3）：207-211.

［10］Mh H，Bn B，Ml E，et al.Associations among hypospadias，cryptorchidism，anogenital distance，and endocrine disruption［J］.Curr Urol Rep，2008，9（2）：137-142.

［11］Lottrup G，Andersson A M，Leffers H，et al.Possible impact of phthalates on infant reproductive health［J］.Int J Androl，2006，29（1）：172-185.