大鼠骨髓间充质干细胞在淋巴细胞增殖中的免疫调节作用＊

天津医科大学第一中心临床学院卫生部危重病急救医学重点实验室（天津300192） 郭瑞雪 沈中阳 宋红丽 杜杰静 张 静 郑卫萍 王玉亮

肝移植是治疗终末期肝病的主要手段之一，但是移植后排斥反应严重影响了疗效和预后。这种排斥反应主要与T细胞介导的免疫应答相关。MSCs低表达主要组织相容性复合体-Ⅰ（MHC-Ⅰ）类分子，不表达MHC-Ⅱ类分子和 B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、CD40或CD40L等共刺激分子，这些特性使得其具有低免疫原性，能够导致T细胞无能，从而抑制免疫排斥或诱导免疫耐受，降低移植排斥发生率［1］。本实验旨在建立体外共培养体系研究BM MSCs对淋巴细胞增殖的抑制机制，现分析报告如下。

材料与方法

1 材料与试剂

1.1 实验动物：Wista大鼠，雄性，体重100～120g，SPF级，4～5周龄，购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

1.2 主要试剂：DMEM／F12培养基（Hyclone公司，美国），Percoll淋巴细胞分离液（Amersham Bioscience公司，美国），胎牛血清（PAA公司，奥地利），胰蛋白酶（Sigma公司，美国），ELISA盒（R＆D System，美国），正常大鼠BRL细胞（中科院上海细胞生化所），抗大鼠的 CD45-PE、CD90-FITC、CD34-FITC、CD29-PE、RT1A-PE、RT1B-FITC、IgG-FITC和IgG-PE（Biolegend公司，美国），抗大鼠的 CD4-FITC、CD25-PE、Foxp3-PE-Cy5（eBioscience公司，美国）。

2 实验方法

2.1 大鼠MSCs的分离和培养：全骨髓培养法分离培养MSCs。具体方法：用5%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠致死，75%乙醇浸泡3min，无菌条件下取其胫骨股骨。剪去其两端骨骺，于10cm2培养皿内使用含15%FBS的DMEM高糖培养基冲洗骨髓腔，制成单细胞悬液。置于含15%FBS、100U／ml青霉素和100U／ml链霉素的DMEM高糖培养基中。37℃，5%CO2、饱和湿度条件下培养48h后换液。此后每2～3d换液1次，细胞生长至80%左右融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取第3代MSCs细胞，调整细胞浓度为2×105／ml备用。

2.2 流式检测大鼠MSCs的表型鉴定：收集生长良好的第3代 MSCs，消化、计数，使细胞浓度为1×106／L，分别加入1.25μl的抗体 CD45、CD29、RT1A，0.5μl的抗体CD90、RT1B，20μl的抗体CD34，同时用IgG作为阴性对照，共孵育30min后，用PBS洗涤，经流式细胞仪检测。

2.3 大鼠脾脏淋巴细胞的制备：用5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠致死，无菌条件下取出脾脏，用200目尼龙网研磨后，应用淋巴细胞分离液获得淋巴细胞，DMEM低糖培养基洗涤2次。调整细胞浓度为1×106／ml备用。

2.4 BRL的制备：将BRL细胞加入10%FBS的DMEM高糖培养基接种于培养瓶，37℃，5%CO2培养，最后调整细胞浓度2×105／ml备用。

2.5 MSCs细胞与淋巴细胞共培养：将淋巴细胞、MSCs、BRL和ConA分别分组接种于6孔培养板，每组3个副孔，每孔总量4ml。

2.6 实验分组：①淋巴细胞组；②淋巴细胞+ConA组；③淋巴细胞+ConA+MSCs组；④淋巴细胞+ConA+MSCs+BRL组。37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养0h、24h和48h。

2.7 ELISA定量检测各组培养上清中TNF-α、TGF-β1、IL-10的含量：待各组共培养0h、24h和48h后收集上清，方法按试剂说明书进行。

2.8 MTT法淋巴细胞混合反应：将MSCs，淋巴细胞，BRL和ConA接种于96孔板，共培养0h、24h和48h后MTT法检测淋巴细胞相对细胞数。

2.9 流式检测Treg含量：取共培养上清液以2500rpm离心5min，弃去上清留下细胞沉淀，按照说明书进行流式检测准备工作。

3 统计学处理 本研究对所有数据采用SSPS17.0统计学软件进行分析处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

结 果

1 骨髓MSCs的形态学观察及表型鉴定

1.1 形态学观察：见图1。刚接种下的骨髓MSCs呈大小较均一的圆形，胞膜清晰，胞体透亮。6h后开始贴壁，48h已牢固贴壁，生长速度较慢，4～5d后可有伪足伸展，以后成为长梭形细胞，出现明显集落，在10d左右可以呈现80%融合。消化传代后细胞平均4～5d再次传代，细胞形态较为均一。

1.2 表型鉴定：见图2。CD90、CD29和RT1A阳性，CD45、CD34和RT1B阴性，说明我们所提取培养的细胞正是骨髓MSCs。

图1 MSCs的体外培养（倒置相差×100）

2 ELISA法检测各组培养上清中3种细胞因子分泌量 见表1。24h和48h的3、4组TGF-β1和IL-10较1、2组表现高分泌（P＜0.05），TNF-α表现低分泌（P＜0.05），0h基本没有变化，TGF-β1分泌随时间延长增高，但IL-10变化不明显（P＞0.05）。

图2 MSCs流式表型鉴定

表1 各组24h和48h的 TNF-α、TGF-β1 和IL-10分泌量（±s，ng／L）

表1 各组24h和48h的 TNF-α、TGF-β1 和IL-10分泌量（±s，ng／L）

注：1组为淋巴细胞；2组为淋巴细胞+ConA；3组为淋巴细胞+ConA+MSCs；4组为淋巴细胞+ConA+MSCs+BRL

TNF-α IL-10组 别TGF-β 0h 24h 48h 0h 24h 48h 0h 24h 48h 1组 2.73±0.21 21.89±0.64 7.70±2.69 71.27±2.98 151.78±5.95 199.67±11.16 55.21±3.26 65.05±1.48 59.920±1.93 2组 2.76±0.16 79.71±4.74 3组 2.75±0.25 25.35±0.36 34.25±1.07 70.74±10.42 201.51±7.81 241.50±4.09 54.58±1.48 85.48±6.37 171.05±14.52 t（2：1） 0.19 6.63 12.96 -0.07 7.16 4.98 -0.25 4.42 5.47 t（3：1） 0.07 -4.46 5.49 -0.73 7.19 12.58 0.10 74.71 26.66 t（3：2） -0.10 -19.20 -14.11 -0.35 4.62 11.23 0.34 13.17 7.83 t（3：4） -0.35 29.95 13.10 -0.43 -5.60 -5.24 -0.27 -5.34 -6.16 t（4：2） 0.32 -31.41 -33.63 -0.05 21.47 10.53 1.03 13.97 8.46 P（2：1） 0.87 0.022 0.006 0.95 0.019 0.038 0.83 0.048 0.032 P（3：1） 0.95 0.047 0.032 0.54 0.019 0.006 0.93 0.000 0.001 P（3：2） 0.93 0.003 0.005 0.76 0.044 0.008 0.77 0.006 0.016 P（3：4） 0.76 0.001 0.006 0.71 0.030 0.035 0.82 0.033 0.025 P（4：2） 0.78 0.001 0.001 0.97 0.002 0.009 0.41 0.005 0.014 107.47±1.63 4组 2.83±0.26 19.76±0.20 18.98±1.10 67.74±6.18 294.92±27.54 387.01±17.86 55.56±3.75 144.86±0.30 3.34±0.75 8.80±0.07 70.33±5.73 413.06±11.54 556.20±42.05 56.35±1.93 160.57±4.15

3 MTT法检测MSCs对淋巴细胞增殖作用结果见表2。24h和48h的3、4组OD值较1、2组降低（P＜0.05），0h基本没有变化（P＞0.05）。

4 流式检测Treg含量结果 见图3。24h和48h的3、4组Treg含量均较1、2组增高（P＜0.05），并且48h含量较高于24h（P＜0.05）。

表2 各组24h和48h的OD值（±s）

表2 各组24h和48h的OD值（±s）

注：1组为淋巴细胞；2组为淋巴细胞+ConA；3组为淋巴细胞+ConA+MSCs；4组为淋巴细胞+ConA+MSCs+BRL

组 别 0h 24h 48h 1组 0.459±0.038 0.353±0.024 0.415±0.024 2组 0.480±0.020 0.563±0.025 0.557±0.021 3组 0.449±0.029 0.229±0.023 0.371±0.023 4组 0.485±0.019 0.104±0.013 0.226±0.032 t（2：1） -1.01411.980 9.023 t（3：1） -1.786-7.441-2.665 t（3：2） -0.421-19.578-11.995 t（3：4） -2.055 9.404 7.407 t（4：2） 1.460-32.208-17.373 P（2：1） 0.350 0.000 0.000 P（3：1） 0.124 0.000 0.037 P（3：2） 0.689 0.000 0.000 P（3：4） 0.086 0.000 0.000 P（4：2） 0.195 0.000 0.000

讨 论

骨髓MSCs主要有赖于其免疫表型而被识别，我们对分离扩增后的骨髓MSCs的表面标志进行了流式细胞仪检测，结果表明骨髓MSCs高表达CD90、CD29和RT1A，不表达CD45、CD34和RT1B，与文献报道一致［2］。许多研究已表明：MSCs可以抑制同种异体抗原对T细胞刺激的反应，但具体机制尚不清楚。有研究认为骨髓MSCs发挥作用是通过细胞-细胞接触，但是更多则认为是通过分泌可溶性因子实现的［3］。本实验建立体外共培养系统观察MSCs对淋巴细胞的影响，检测发现抑炎细胞因子TGF-β1和IL-10的含量在含有骨髓MSCs组均显著增高，促炎细胞因子TNF-α含量降低，以及Treg含量增高，说明MSCs能够促进负性免疫应答。

图3 Treg流式图

TGF-β1是免疫系统中良好的负性调节因子，能够诱导自身耐受和器官耐受，维持免疫平衡［4］。Bertolo等［5］将 MSCs与外周血淋巴细胞共培养发现TGF-β1表达增加。Qian等［6］等的研究也证实了TGF-β1在MSCs对淋巴细胞的抑制作用中非常重要，我们的实验结果与之一致，同时证明了这种作用随时间延长几乎没有改变。

IL-10是另一重要的负性免疫调节因子，能够抑制单核／巨噬细胞 MHC-Ⅱ类分子，间接降低T细胞增殖。Gao等［7］发现IL-10在MSCs发挥抑制作用中有着重要作用。这与我们的实验结果一致，但是有部分学者认为：在MSCs对淋巴细胞抑制过程中，IL-10的分泌量没有增加，其具体机制有待证实。

TNF-α除致炎作用外，还能够促进T细胞、胸腺细胞以及B细胞等的增殖和分化，参与某些免疫病理过程。方 翔［8］等经动物实验发现骨髓MSCs移植能够降低肺气肿大鼠血浆中TNF-α的含量。这与我们实验结果相同，说明骨髓MSCs能够通过降低TNF-α的分泌来减弱淋巴细胞的增殖和分化。

Treg是一类表面高表达IL-2受体α链（CD25）、胞质中表达Foxp3转录因子的CD4+T细胞，能够抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖，达到负性调节以及自身免疫耐受的作用。Wang等［9，10］经动物实验发现：骨髓MSCs移植能够显著增加外周血和淋巴结中Treg的含量，抑制急性排斥反应，延长受鼠的生存时间。我们的体外实验得到了相同结果，这表明MSCs能够通过提高Treg含量抑制淋巴细胞增殖。

肝脏作为“免疫特惠器官”表现一定程度的天然免疫耐受性，移植排斥反应发生率和严重度较少较轻，但是这仍然是移植失败的一个主要因素。我们在共培养体系中加入BRL，想由此来了解骨髓MSCs在大鼠正常肝细胞存在情况下是否仍然对淋巴细胞起到抑制作用。

总之，骨髓MSCs具有抗炎和免疫调节的能力，使其成为治疗免疫系统紊乱引起的疾病的潜在方法，例如移植后排斥反应。

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