外周血内皮祖细胞与极低出生体重早产儿并发症发生相关性

祁媛媛 姜 茜 陈 超 曹 云 钱莉玲

内皮祖细胞(EPCs)是一类具有自我更新和高度增殖能力的血管前体细胞，可以在某些病理因素的刺激下由骨髓动员至外周血循环中，参与血管重建和新生［1］。同时，EPCs还可以释放相关因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子(SDF-1)等，从而促进血管生成、减少凋亡，一些生长因子如VEGF等可以促进EPCs的动员。成人的研究显示，骨髓来源的EPCs可促进缺血及血管损伤组织的血管修复，在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征、心血管疾病等中均起重要作用［2，3］。有文献报道严重视网膜黄斑退化的患者外周血CD34+细胞的数量减少，内皮集落形成能力减弱［4］。近来年，EPCs在早产儿血管异常中的作用也越来越受到关注［5～7］。

Balasubramaniam等［8］发现高氧使新生小鼠 EPCs降低，从而使肺血管生长受损，肺泡生长障碍。晚近的临床研究显示发生BPD的早产儿出生时的脐血EPCs集落数减少［9，10］，提示出生时 EPCs减少可能参与了 BPD的发生。然而，另一项研究未发现出生时外周血EPCs与BPD发生的相关性［11］。这些结果的差异提示脐血并不能代表外周血EPCs的水平，因为生后外周血EPCs水平受氧、炎症损伤等多种因素的影响。而目前仍无研究系统地评估EPCs在早产儿并发症中的作用。那么，EPCs在早产儿相关并发症中的作用究竟如何?本研究分析生后不同时点EPCs的动态变化，及其与不同早产并发症的相关性。

1 方法

1.1 纳入和排除标准 ①2011年7月至2012年4月复旦大学附属儿科医院(我院)NICU住院的、胎龄＜32周的、出生体重＜1 500 g的和生后6h内入我院的新生儿，并排除未取得知情同意的、病情不稳定的和存在明显先天畸形者。1.2 数据剔除标准 观察结束后数据分析时，剔除染色体畸形、青紫型先天性心脏病、慢性宫内缺氧、换血治疗、败血症、放弃治疗出院或死亡等病例的数据。

1.3 诊断、分组和伦理BPD组:纠正胎龄36周仍需氧疗维持正常氧合，X线胸片显示双肺不同程度的肺纹理增多模糊或毛玻璃影、囊泡形成、线状及网格状影;ROP组:参照ROP国际标准(ICROP)诊断［12］;IVH组:通过头颅B超或头颅影像学检查诊断;对照组:未发现BPD、ROP和IVH的住院早产儿。本研究方案获得我院伦理委员会审核批准。

1.4 标本收集及处理

1.4.1 标本采集 于出生时，生后7、14、21和28d及纠正胎龄36周时，取临床必要的抽血检查的剩余动脉抗凝血标本。1.4.2 外周血EPCs检测 用流式细胞分析仪检测外周血EPCs水平。取外周血100μL，分别加入10μL CD34-FITC抗体(美国 BD 公司)、10μL KDR-PE 抗体(R＆D 公司)和CD133-APC(Meltenyi公司)抗体，同时对照管加入100μL标本，分别加入CD34、CD133和KDR同型对照抗体，室温避光孵育20 min。加入1mL溶血素溶解红细胞，离心后加入去离子水待检测。采用不同的表面分子组合CD34+KDR+、KDR+CD133+、CD34+KDR+CD133+细胞代表EPCs水平，CD34+、CD133+细胞代表骨髓来源的干/祖细胞水平。

1.4.3 血浆SDF-1、VEGF和GM-CSF检测 参照SDF-1、VEGF和GM-CSF因子ELISA试剂盒(R＆D公司)说明书操作。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析。连续变量采用±s表示，组间比较采用t检验，非连续变量用计数或率表示，率的比较采用χ2检验或Fisher's精确检验。(P＜0.05)为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 研究期间101例极低出生体重儿符合纳入排除标准，经数据剔除标准检验后，最终68例极低出生体重早产儿进入本文分析(图1)。

图1 研究对象纳入和排除流程图Fig 1 Flow chart of including and excluding procedure of study subjects

平均胎龄(29.3±1.6)周，平均出生体重(1 246±228)g。BPD组20例，ROP组10例，IVH组8例，对照组30例。BPD组、ROP组和IVH组的胎龄、出生体重差异无统计学意义，但BPD组、ROP组的胎龄均低于对照组，差异有统计学意义(表1)。

表1 4 组患儿的基线资料［±s，M(range)，n(%)］Tab 1 Baseline characteristics of infants in four groups［ ± s，M(range)，n(%)］

表1 4 组患儿的基线资料［±s，M(range)，n(%)］Tab 1 Baseline characteristics of infants in four groups［ ± s，M(range)，n(%)］

Notes GA:gestational age;BW:birth weight;PROM:premature rupture of membranes;BPD:bronchopulmonary dysplasia;ROP:retinopathy of prematurity;IVH:intraventricular hemorrhage.BPD vs control(GA，P=0.000，BW，P=0.000，Apgar score，P=0.005);ROP vs control(GA，P=0.016);IVH vs control(BW，P=0.023).Other variables had no siginificant difference between ROP，BPD，IVH and control groups

Parameters GA/week BW/g 5 min Apgar scorePROM Male BPD(n=20)28.4±1.7 1 138±214 7(3-10)3(16.0)11(55.0)ROP(n=10)28.9±1.3 1 297±154 8(3-10)3(30.0)5(50.0)IVH(n=8)29.1±1.6 1 153±235 7(5-9)1(16.7)3(50.0)Control(n=30)30.3±1.4 1 389±256 9(5-10)4(13.3)19(63.3)

2.2 BPD组和对照组外周血EPCs水平比较 图1显示，BPD组和对照组出生时点CD34+细胞水平均最高，7d时点明显下降。与7d时点相比，CD34+细胞水平在随后的不同时点中有轻微的下降趋势，但差异无统计学意义。出生时点BPD组和对照组WBC计数差异无统计学意义，(12.7±8.1)×109·L-1vs(9.3±6.5)×109·L-1，P=0.153。BPD组与对照组出生时点EPCs水平差异无统计学意义。生后 7d时点 CD34+KDR+、KDR+CD133+及CD34+KDR+CD133+EPCs水平BPD组均较对照组明显降低，CD34+KDR+:(0.019 ±0.009)% vs(0.026±0.012)%，KDR+CD133+:(0.004±0.002)%vs(0.008±0.004)%，CD34+KDR+CD133+:(0.005±0.002)%vs(0.008±0.004)%;P均＜0.05。生后14d时点EPCs水平BPD组较对照组有下降趋势，但差异无统计学意义。生后21d时点的CD34+KDR+细胞水平BPD组也较对照组下降，(0.016±0.010)%vs(0.023±0.012)%，(P＜0.05)。在生后28d和纠正胎龄36周时点两组EPCs水平差异无统计学意义。

图2 BPD、ROP、IVH与对照组患儿生后不同时点外周血EPCs比较Fig 2 Comparisons of circulating EPCs among control，BPD，ROP and IVH infants atdifferent time points

表2显示，从出生至生后21d时点，VEGF水平BPD组均较对照组显著降低，差异有统计学意义。各观察时点SDF-1和GM-CSF水平BPD组与对照组差异均无统计学差异。

2.3 ROP组和对照组外周血EPCs比较 图1显示，出生时CD34+、CD133+细胞水平ROP组较对照组显著升高，CD34+:(0.970±0.551)%vs(0.667±0.323)%，CD133+:(1.466±0.693)%vs(0.207±0.306)%;P均＜0.05。出生时 CD34+KDR+、KDR+CD133+和 CD34+KDR+CD133+EPCs细胞水平在两组间差异无统计学意义。生后7d时点，CD34+和CD133+细胞及EPCs水平两组差异均无统计学意义。生后14、21和28d时点ROP组与对照组外周血EPCs水平差异无统计学意义。在纠正胎龄36周时，外周血KDR+CD133+EPCs和CD34+KDR+CD133+EPCs水平ROP组较对照组有升高的趋势，KDR+CD133+:(0.010±0.003)%vs(0.007±0.003)%，P=0.053;CD34+KDR+CD133+:(0.009±0.005)% vs(0.006± 0.003)%，P=0.061。

2.4 IVH组和对照组外周血EPCs比较 图1显示，出生时CD34+细胞水平和EPCs细胞水平IVH组与对照组差异无统计学意义。在生后7d时点，ICD34+、CD133+和CD34+CD133+细胞水平IVH组较对照组明显升高，CD34+:(0.642±0.323)% vs(0.370±0.137)%，CD133+:(0.516±0.289)%vs(0.277± 0.103)%，CD34+CD133+:(0.499±0.283)%vs(0.235±0.113)%;P均＜0.05;而EPCs水平差异无统计学意义。在随后的各观察时点两组的EPCs水平差异无统计学意义。

表2 细胞因子在BPD组与对照组不同时点比较±s)Tab 2VEGF，SDF-1，and GM-CSFplasma concentrations in control and BPD infants±s)

表2 细胞因子在BPD组与对照组不同时点比较±s)Tab 2VEGF，SDF-1，and GM-CSFplasma concentrations in control and BPD infants±s)

Notes BPD:bronchopulmonarydysplasia;VEGF:vascular endothelial growth factor;SDF-1:stromal cell-derived factor-1;GM-CSF;granulocytemacrophage colony-stimulating factor

Group 0d 7d 14d 21d 28d VEGF/pg·mL-1 BPD 198.2±156.4 394.3±127.9 400.8±78.9 287.4±163.9502.8±202.8 Control 768.6±445.2 741.1±434.5 602.0±240.1 648.5±412.5 534.8±307.4 P 0.040 0.028 0.031 0.043 0.895 SDF-1/ng·mL-1 BPD 2.0±1.2 2.3±0.8 2.7±0.9 2.9±0.8 2.6±0.6 Control 3.1±0.7 3.3±0.4 3.3±0.7 3.6±0.8 2.9±0.7 P 0.180 0.191 0.236 0.168 0.268 GM-CSF/ng·mL-1 BPD 1.6±1.5 2.6±1.8 2.2±0.8 2.5±1.3 1.9±1.1 Control 2.9±0.5 4.5±1.5 2.8±1.5 4.0±2.4 3.2±2.8 P 0.157 0.138 0.415 0.1360.094

3 讨论

EPCs在血管的生成、维持和修复中均起重要的作用，多项研究显示EPCs参与了血管性疾病的发生。本文采用流式细胞仪检测外周血EPCs的水平。值得注意的是，目前国际上对EPCs的定义及检测方法仍未形成统一标准。通常采用的方法包括细胞培养集落计数和流式细胞仪检测。这两种方法的检测结果可能不一致［13］。细胞培养需要在外界环境中培养一定的时间，且不能完全反映体内的生物学特性;而流式细胞仪通过检测细胞的表面抗原快速评价EPCs水平，更适于临床应用。目前常用的检测EPCs的表面标记包括CD34、KDR和CD133，每种标记可能代表了EPCs分化的不同阶段［14，15］。本研究采用了3种标记的组合 CD34+KDR+、KDR+CD133+和 CD34+KDR+CD133+代表EPCs水平。

EPCs与BPD发生的相关性近年来的研究显示了不同的结果。Borghesi等［9］发现出生时脐血EPCs集落和外周血EPCs水平低的患儿发生BPD的风险增加。而Paviotti等［11］研究显示出生时流式细胞仪检测的EPCs水平与BPD的发生不相关。与以上结果不同，一项晚近的研究发现出生时EPCs水平高的患儿易发生BPD，但该研究未排除胎龄的影响［16］。本研究未发现出生时EPCs水平与BPD发生的关系，但BPD组胎龄显著低于对照组。目前已证实胎龄与生后尤其是48h内的祖细胞水平呈负相关［17］，这可能是两组EPCs未发现差异的原因。本研究发现BPD组生后7d时点的EPCs水平较对照组明显下降，这在既往文献中未见报道。提示生后早期EPCs水平降低可能参与了早产儿BPD的发生。

VEGF信号通路在生后早期血管和肺泡发育中起重要的作用［18，19］。动物研究显示新生儿期阻断VEGF受体会造成肺结构破坏，产生与 BPD病理相同的表现［20，21］。同时，VEGF还是重要的EPCs动员调节因子［22］。本研究发现与对照组相比，BPD组血浆VEGF水平从出生到生后21d均明显降低。由此推测VEGF的降低是导致EPCs降低及肺血管发育异常的原因。然而，VEGF降低的机制及与EPCs降低的因果关系仍需进一步研究。

ROP的发生与视网膜毛细血管的发育异常密切相关。在本研究中，ROP组出生时骨髓来源的循环干/祖细胞较对照组明显升高，与以往的研究结果一致［9］。然而，ROP组胎龄明显低于对照组，可能是循环CD34+细胞增高的原因。有研究显示，发生ROP的早产儿生后10周外周血EPCs水平显著高于未发生ROP的患儿［23］。本研究中出生时、生后7～28d均未发现ROP组和对照组患儿EPCs水平的差异，但在纠正胎龄36周时ROP组外周血EPCs有高于对照组患儿的趋势，与以往研究结果相似。但EPCs的动态变化在ROP发生中的作用及机制仍需深入研究。另外，本研究发现生后7d时点IVH组CD34+细胞水平升高，这可能与出血、血管损伤促进骨髓干/祖细胞动员有关。EPCs在IVH的作用仍不确定，需进一步的研究。

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