BEZ235对A549细胞增殖及akt、mek、erk mRNA表达的影响

张 芳，韩 娜，蔡 晶，方 黎，张中冕

郑州大学第二附属医院肿瘤科 郑州 450014

肺癌是目前全球范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。中国非小细胞肺癌患者占肺癌总数的75%～80%，多数患者在确诊时已处于晚期，失去手术治疗的机会；接受根治性手术的患者也多数因复发及远处转移而导致治疗失败，药物治疗仍是晚期非小细胞肺癌治疗的重要手段之一[1-4]。新型药物BEZ235是磷酸肌醇3(PI3K)和其下游因子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的双重靶向抑制剂，已表现出良好的抑制多种实体瘤的作用[5-8]。该研究以人肺腺癌A549细胞为研究对象，观察BEZ235对A549细胞增殖及akt、mek、erk mRNA表达水平的影响, 初步探讨BEZ235在肺癌治疗中的作用，为临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1实验材料BEZ235购自上海翊圣生物科技有限公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所，RPMI 1640培养液和2.5 g/L胰蛋白酶购自美国Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)和MTT购自Sigma公司。A549细胞株由郑州大学第二附属医院中心实验室提供。akt、mek和erk扩增引物序列和扩增产物长度见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2细胞培养与分组A549细胞用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(内含青霉素100 kU/L、链霉素100 mg/L)，置于体积分数5% CO2、37 ℃恒温孵箱中培养。每1～2 d 传代1 次，取对数生长期细胞进行实验。实验分为4组，对照组(仅含细胞和培养液而不含药物)，BEZ235低、中、高剂量组(分别加入2.5、5和10 mol/L BEZ235)，培养24、48、72 h。

表1 akt、mek和erk扩增引物序列和扩增产物长度

1.3细胞增殖抑制率检测取对数生长期的A549细胞，经胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL，细胞密度约为5 000个/孔，置恒温培养箱中孵育12 h后吸出原培养液，按照1.2中分组处理，每组设6个复孔。实验中止前4 h，每孔加入20 μL 5 g/L 的MTT培养4 h 后，再加入150 μL DMSO，振荡10 min。以空白对照孔调零，在492 nm 波长处用自动酶标仪测定每孔的吸光度(A)值。细胞增殖抑制率 = (1-A实验/A阴性对照)×100%。

1.4akt、mek、erkmRNA的检测采用RT-PCR。取对数生长期的A549细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化成细胞悬液，以1×105mL-1接种于6孔板，每孔2 mL，常规培养，12 h后完全贴壁，按照1.2中分组，作用48 h后终止。细胞经PBS洗涤后, 每孔加入1 mL Trizol，提取总RNA，逆转录为cDNA。PCR扩增条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共33个循环；最后72 ℃延伸15 min。扩增产物经1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳(120 V，18 min) 后，紫外透射仪下观察并照相，以目的基因与内参条带亮度的比值代表mRNA的相对表达量，实验重复3次。

1.5统计学处理采用 SPSS 17.0处理数据。采用3×3析因设计的方差分析比较不同浓度BEZ235作用不同时间对A549细胞增殖抑制率的影响；采用单因素方差分析比较不同浓度BEZ235作用于A549细胞48 h后akt、 mek及erk mRNA表达水平的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1BEZ235对A549细胞增殖的影响随着BEZ235作用浓度的升高及作用时间的延长，A549细胞的增殖抑制率升高，呈浓度、时间依赖性。见表2。

表2 各组细胞增殖抑制率比较(n=6) %

F组间=233.315，F时间=171.598,F交互=6.770，P均<0.001。

2.2BEZ235对A549细胞akt、mek、erkmRNA表达的影响RT-PCR结果显示，各组均可检测到akt、mek、erk mRNA的表达，见图1。

图1 不同浓度BEZ235作用48 h后A549细胞akt、mek、erk mRNA的表达

随着BEZ235浓度的增高，akt mRNA的表达水平下降，而mek、erk mRNA的表达水平无明显改变，见表3。

3 讨论

PI3K/Akt/mTOR和Raf/MEK/ERK是两条重要的信号转导通路，在肿瘤细胞的生长、增殖、迁移和凋亡中起关键作用，这两条通路是抗肿瘤药物治疗的有效靶点，且PI3K/Akt/mTOR和Raf/MEK/ERK信号通路间可能存在特异信号交流[9-11]，Akt 通过使Raf 磷酸化可有效抑制Raf 的活性，如果使用抑制剂抑制Akt的活性，则Raf/MEK/ERK通路的活性增强[12]。新型药物BEZ235是PI3K和mTOR双激酶抑制剂，可竞争性结合酶的ATP结合槽，目前已进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验。Xu 等[13]的研究表明BEZ235对于雷帕霉素耐药的细胞具有很好的抑制作用；Engelman等[14]的研究表明BEZ235对存在k-ras突变的肺癌小鼠的抑瘤效果并不佳，当联合MEK抑制剂时抑瘤效果明显好于单用BEZ235，二者联合有显著的协同抑瘤作用。

为了探讨BEZ235作为PI3K/mTOR的双重抑制剂在发挥其抑瘤作用时是否会对Raf/MEK/ERK通路产生影响，该研究以肺癌A549细胞为研究对象，通过MTT检测不同浓度BEZ235处理后对细胞增殖的抑制作用，同时选择在肿瘤发生、发展中起重要作用的PI3K/Akt/mTOR与Raf/MEK/ERK两条通路上的关键分子akt、mek和erk, 通过RT-PCR检测相关mRNA表达水平的变化。结果表明，BEZ235能够抑制A549细胞增殖，且抑制作用呈浓度和时间依赖性；RT-PCR结果显示BEZ235可降低A549细胞akt mRNA的表达水平，但对mek、erk mRNA的表达水平无明显影响。

总之，该研究结果显示，BEZ235能够呈浓度和时间依赖性抑制A549细胞增殖，这种抑制作用可能与下调akt mRNA的表达有关。BEZ235在肺癌中的作用有待进一步深入研究，从而为联合用药及临床治疗提供实验基础。

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