新型核苷类似物FNC对Raji细胞增殖、凋亡和Bcl-6、PRDM1、C-myc表达的影响*

张 艳，程旭芳，黄 刚，董静静，王陈萍，江金花，王庆端#，常俊标#

1)郑州大学医药科学研究院 郑州 450052 2)郑州大学药学院 郑州450001 3)郑州大学化学与分子工程学院 郑州 450001

恶性淋巴瘤是一种起源于淋巴造血组织的实体瘤，临床表现变化多端，特别是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)，易侵犯结外组织，给临床诊断和治疗带来很大困难。化学治疗在侵袭性NHL的综合治疗中占主导地位，但传统化疗方案的治愈率较低[1]。目前，核苷类似物作为一类重要的抗肿瘤药物，占据抗癌药物市场近五分之一的份额[2]。核苷类药物的化学结构与体内正常代谢物相似，可掺入到细胞的DNA与RNA中，抑制核酸的生成，干扰细胞的正常代谢。2’-脱氧-2’-氟-4’-叠氮-核苷类似物(FNC)由郑州大学化学与分子工程学院合成，前期的研究[3]发现FNC可能对NHL有较好的治疗作用。作者选用高侵袭性人Burkitt淋巴瘤Raji细胞作为研究对象，探讨FNC对Raji细胞增殖的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器RPMI 1640培养液、DMSO和四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Solarbio公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；Annexin-Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；Trizol购于英俊公司；RT-PCR试剂盒购于宝生物公司；PCR引物由宝生物公司合成； Bcl-6、C-myc、β-actin抗体和山羊抗兔IgG均购于博奥森公司；PRDM1抗体购自Santa Cruz公司。Raji细胞购自中国科学院上海细胞库，使用含有体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在饱和湿度、37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中常规培养。PCR扩增仪(Biometra公司)；凝胶成像分析系统和核酸蛋白分析仪(Eppendorf 公司)；DYY-6C型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)；酶联免疫检测仪、垂直电泳系统和电转系统(Bio-Rad公司)；流式细胞仪(Beckman Coulter公司)；紫外透射分析仪(柯达公司)。

1.2细胞增殖情况的检测采用MTT法。取对数生长期的细胞，调整细胞密度为9×107L-1，接种于96孔培养板中，100 μL/孔，实验组分别加 0.035、0.350、3.500、35.000、350.000 μmol/L FNC，每个浓度均设5个复孔。同时设空白组(只加培养液)、阴性对照组(不加药)。培养24、48和72 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，继续培养4 h。离心25 min，吸弃上清液，加入 DMSO 150 μL/孔，振荡混匀后，用酶联免疫检测仪测570 nm波长下各孔的吸光度(A)值。实验重复3次。细胞增殖抑制率=(1-实验组平均A值/阴性对照组平均A值)×100%。

1.3细胞周期的检测取对数生长期细胞，以1.5×109L-1的密度接种于6孔板中，分组处理，分别加入不同浓度的FNC或等体积培养液，使终浓度为0(对照)、0.035、0.175、0.875、4.375 μmol/L，培养48 h后收集细胞。用预冷的PBS洗涤细胞2次，离心5 min，弃上清液。加入预冷的乙醇溶液固定，于4 ℃下过夜。用流式细胞仪分析，按Cell Quest软件检测并分析细胞周期分布。实验重复3次。

1.4细胞凋亡的检测实验分组同1.3，培养48 h后收集细胞，用预冷的PBS洗涤并离心，按 AnnexinⅤ-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书操作，于1 h内上流式细胞仪，用Cell Quest软件检测并分析细胞凋亡和死亡的情况。结果判断：FITC-/PI-为活细胞，FITC-/PI+为坏死细胞，FITC+/PI-为凋亡细胞， FITC+/PI+为凋亡后继发死亡的细胞。实验重复3次。细胞凋亡率=(凋亡细胞数+继发死亡细胞数)/全部细胞数×100%。

1.5细胞中Bcl-6、PRDM1、C-mycmRNA的检测

采用RT-PCR 法。实验分组同1.3，培养48 h后收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，弃去上清，加入Trizol提取细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR。引物设计见表1。PCR反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，退火(Bcl-6为52 ℃，PRDM1为56 ℃，C-myc为53 ℃)50 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸7 min ，4 ℃保存。于30 g/L琼脂糖凝胶上电泳，用紫外透射分析仪观察结果。实验重复3次。采用Quantity one进行条带光密度测定，以目的基因与β-actin 条带光密度的比值作为目的基因mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

1.6细胞中Bcl-6、PRDM1、C-myc蛋白的检测采用Western blot法。实验分组同1.3，培养48 h后收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，弃上清，提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白含量。取蛋白30 μg进行SDS-PAGE电泳，将蛋白样本转移至NC膜上，用5 g/L脱脂奶粉封闭1 h，分别加入抗Bcl-6、抗PRDM1和抗C-myc多克隆抗体(均稀释200倍)，4 ℃ 过夜。加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(稀释1 000倍)，脱色摇床摇1 h，ECL显影成像。实验重复3次。用 Quantity one进行条带光密度测定，以目的蛋白与β-actin条带光密度的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0 进行分析，采用5×3析因设计的方差分析对细胞增殖抑制率进行分析，应用单因素方差分析对各组细胞周期、凋亡率和Bcl-6、PRDM1、C-myc mRNA及蛋白的相对表达量进行分析，两两比较用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1FNC对Raji细胞增殖的影响见表2。

表2 FNC处理后Raji细胞增殖抑制率测定结果(n=3) %

F浓度=4 869.984，F时间=1 785.062，F交互=126.281，P均<0.001。

2.2FNC对Raji细胞周期及凋亡的影响见表3。

表3 FNC处理48 h后Raji细胞周期及凋亡率测定结果(n=3) %

*：两两比较，P均<0.05。

2.3FNC对Raji细胞Bcl-6、PRDM1、C-mycmRNA和蛋白表达的影响RT-PCR和Western blot结果见图1、2，FNC处理48 h后Raji细胞Bcl-6、PRDM1及C-myc mRNA与蛋白表达的分析结果见表4。

图1 Bcl-6、PRDM及C-myc mRNA测定结果

表4 FNC处理48 h后Raji细胞Bcl-6、PRDM1及C-myc mRNA与蛋白的表达(n=3)

*：两两比较，P均<0.05。

3 讨论

作者通过MTT法检测显示，FNC对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞的增殖具有明显的抑制作用，呈剂量、时间依赖性。

近年研究[4]发现，细胞周期调控异常和细胞凋亡在肿瘤的发生发展中起重要作用。细胞增殖是通过细胞周期的运转来实现的。该研究结果显示，随着FNC浓度的增加，G0/G1期细胞增多，提示FNC抑制细胞的增殖可能与其阻滞细胞从G0/G1期向S期的转变有关，使细胞不能进入S期进行DNA的合成，最终导致增殖抑制，该作用呈明显的剂量-效应关系，提示诱导凋亡可能是FNC抗肿瘤作用的机制之一。

Bcl-6是一个含有锌指结构的转录抑制因子，是原癌基因，在很多类型的淋巴瘤中都能检测到Bcl-6基因的异常高表达。Bcl-6可以通过抑制p27及CCND2的表达，促进淋巴瘤细胞增殖；通过抑制PDCD2基因及P53基因，抑制淋巴瘤细胞凋亡[5-6]。Bcl-6可通过抑制PRDM1表达，抑制B细胞分化为成熟的浆细胞，从而导致淋巴瘤的发生[7]。PRDM1是一个含有5个锌指结构的转录抑制因子，是抑癌基因，又名B淋巴细胞诱导成熟蛋白，是参与B细胞和T细胞终末分化的关键调控因子[8-9]，PRDM1功能的异常可导致B细胞不能分化为浆细胞而最终导致肿瘤的发生。研究[10]显示PRDM1有α与β转录本，可能是2个转录本的表达及比例异常导致了肿瘤的发生。C-myc是PRDM1直接抑制的下游基因[11]，是一个原癌基因。C-myc是Burkitt淋巴瘤的遗传学标志[12]，其功能是改变细胞周期、凋亡，促进细胞增殖及抑制细胞分化而引起淋巴瘤的发生[13]。C-myc 基因的异常表达是癌变过程中较早出现的分子改变，活化的C-myc 可以作为原癌基因参与肿瘤的形成及发展[14]。C-myc也可通过抑制其下游基因，而对细胞的凋亡和细胞周期产生影响[15]。该研究结果显示，在FNC作用下，Raji细胞中Bcl-6的表达降低，PRDM1的表达升高，从而导致C-myc的表达降低，从而产生抗肿瘤作用。

综上所述，FNC可下调Bcl-6、C-myc的表达，上调PRDM1的表达，从而抑制Raji细胞的增殖，诱导细胞凋亡。这可能是FNC抗肿瘤作用的重要机制。

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