亨廷顿舞蹈病患者mtDNA D环突变及编码区大片段缺失分析

姜 楠，周 璐，肖 海，李晓文#

1)郑州大学临床医学系 郑州 450001 2)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室 郑州 450001

mtDNA突变主要引起神经肌肉系统退行性病变[1]，可能是亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease，HD)、Parkinson、小脑共济失调等多种神经系统退行性病变发病的早期信号[2-5]。mtDNA D环对mtDNA的复制和转录有重要的控制作用，D环高变区点突变与多种恶性肿瘤、糖尿病、衰老等疾病密切相关[2-5]。作者初步探讨mtDNA D环突变及编码区大片段缺失与HD发生的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象两个HD家系均来自河南省，经知情同意后，抽取患者8人、家系内正常者20人和家系外正常者20人外周静脉血各3 mL进行检测。受检者均经IT-15基因检查明确诊断。

1.2mtDNAD环高变区及编码区突变检测采用酚-氯法提取外周血全基因组DNA，进行PCR。引物序列来源于GenBank，见表1、2，均由上海生工生物工程有限公司合成。mtDNA D环高变区扩增体系共50 μL：Mix(含染料)25 μL，上、下游引物各1 μL(终浓度10 μmol/L)，模板DNA 5 μL, ddH2O 18 μL。mtDNA编码区反应体系共20 μL：Mix(含染料)10 μL，上、下游引物各1 μL(终浓度10 μmol/L), 模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应条件均为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸35 s，循环35次；72 ℃延伸10 min。产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像分析系统摄影并保存图像。扩增产物由北京金唯智生物公司测序后，与人类线粒体剑桥序列(Cambridge reference sequence,CRS)进行比对。

表1 高变区引物序列

表2 编码区引物

2 结果

2.1mtDNAD环高变区检测结果所有测试对象样本均有效扩增。D环高变区Ⅰ、Ⅱ均扩增出相应产物片段，未见片段缺失或插入突变；测序结果与CRS比对，亦未发现片段缺失或插入突变。受检者mtDNA D环高变区测序结果与CRS比对结果见表3～5。其中高变区Ⅰ的rs16061～rs16171是核苷酸歧变的集中区域，突变率达55.6%。

2.2mtDNA编码区检测结果3名(37.5%)患者和16名(80.0%)家系内正常人mtDNA编码区A、B、C、D片段缺失，与CRS比对分析，缺失类型、位置及缺失片段长度见表6。

表3 家系外正常人mtDNA D环高变区测序结果与CRS的比对(n=20)

表4 家系内正常人mtDNA D环高变区测序结果与CRS的比对(n=20)

表5 患者mtDNA D环高变区测序结果与CRS的比对(n=8)

表6 mtDNA编码区大片段缺失类型、位置及缺失片段长度

3 讨论

HD是一种迟发型神经系统退行性疾病，病因主要是由于IT-15基因CAG重复序列异常扩增，导致其所编码的亨廷顿蛋白结构与功能异常[6]。线粒体是真核细胞中能量传导的细胞器，参与调控细胞凋亡、基因表达和信号传导，mtDNA突变、氧化磷酸化异常及能量代谢障碍均影响细胞的正常结构及功能。多种神经系统退行性病变中，中枢神经系统糖代谢异常和氧化磷酸化系统损伤出现于神经元丢失、认知功能减退等病理改变之前[4]，说明线粒体功能障碍较早参与了多种神经退行性疾病的发病过程。

人类mtDNA是一个双链闭环DNA分子，含有37个基因，编码13种蛋白质、22种转移RNA(tRNA)和2种核糖体RNA(rRNA)[7]。 mtDNA不含内含子，惟一的非编码区是约1 000 bp的D环，又称调控区，是线粒体基因组和核基因组信息交换的枢纽，包含了1个复制起始点、2个转录启动子和4个保守序列，对mtDNA的复制和转录有重要的控制作用。mtDNA具有高突变率且尤以D环区最为常见，包括点突变、片段缺失和插入突变,其16024～16365 nt及73～340 nt两个区域为多态性高发区，分别称为高变区Ⅰ和高变区Ⅱ。作者对HD患者、家系内正常人和家系外正常人的mtDNA D环进行突变检测，未检测到片段缺失或插入，提示mtDNA D环片段重组可能不是HD发病机制中的重要因素。但在rs16139、rs16378、rs16422等位点出现单个碱基改变，提示这些位点可能与HD的易患性或病程演变有关，有待进一步扩大相同母系人员样本证实。此外，与CRS相比，家系外正常人mtDNA D环高变区Ⅰ变异率可达80%，而且变异类型较多，其中约55.6%发生在rs16061～rs16171区域，该区域是核苷酸歧变的集中区域。该结果提示中国汉族人的mtDNA序列与CRS可能存在较明显的种族差异，应进一步扩大样本研究[8]。

有报道[9]，约62.5% HD患者mtDNA编码区存在大片段缺失，缺失类型与CAG三核苷酸重复无关，正常人中未见大片段缺失。作者对8名患者及20名家系内正常人进行mtDNA编码区检测，发现3名HD患者和16名家系内正常人存在大片段缺失，未发现HD与mtDNA编码区大片段缺失有特异相关性，推测与mtDNA对表型的阈值效应有关，即家系内正常个体IT-15基因正常，而缺失型mtDNA的数量未能达到阈值，因此不表现出明显的能量代谢障碍。正常个体出现mtDNA编码区大片段缺失的机制有待进一步研究。

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