瑞舒伐他汀对大鼠急性心肌梗死后梗死组织miR-126的表达及血管再生的影响

孙 涛，万大国，宋恒良，孙慎杰

郑州大学第二附属医院心内科 郑州 450014

心肌梗死发病的主要机制是心肌缺血，心肌血运重建术已经成为治疗心肌梗死的主要方法。血管生成是一个受多种信号分子和通路精确调控的复杂过程，在多种促血管生成细胞因子的诱导下，内皮细胞、血管平滑肌细胞和成纤维细胞经过活化、迁移、增殖，逐步装配形成管腔。miRNA在许多生物学过程如细胞增殖、分化、凋亡、癌症发生中发挥重要的调控作用。最近研究[1]表明，miRNA也参与调控心血管系统的发育和疾病发生过程。新生血管形成是心肌梗死后心脏修复的必经环节。miR-126位于内皮细胞特异表达基因 egfl7的第 7 个内含子中，与egfl7共同转录；miR-126 通过抑制两个血管新生的负调控因子Spred-1和 PI3KR的表达参与血管新生信号转导，维持血管完整性[2]。他汀类药物除具有降低血脂的作用外，在急性冠状动脉综合征患者中早期应用能够抑制血管内皮的炎症反应，稳定粥样斑块，改善血管内皮功能，具有延缓动脉粥样硬化(AS)程度、抗炎、保护神经和抗血栓等作用[3]。作者观察了瑞舒伐他汀对大鼠心肌梗死后梗死组织miR-126的表达和微血管密度(MVD)的影响，探讨其与血管再生的关系。

1 材料与方法

1.1材料Trizol购自Invitrogen公司，LA Taq酶、has-miR-126定量PCR检测试剂盒均购自Transgene公司，其他试剂均为国产试剂。80只清洁级成年SD健康大鼠购自郑州大学实验动物中心，合格证号为SCXK(豫)：2011-0005；雌雄不拘，2～3月龄，体质量225～350 g。

1.2实验分组参照文献[4-5]的方法，缝扎大鼠左前降支动脉建立急性心肌梗死模型，有62只大鼠存活，术后24 h采用随机数字表法分为2组，每组31只。次日起瑞舒伐他汀组给予瑞舒伐他汀10 mg/(kg·d)连续灌胃6周，模型组给予等量助溶溶剂连续灌胃6周。6周中2组各有4只动物死亡，6周后处死动物，取梗死部位心肌组织标本。

1.3MVD检测参照文献[6]方法计数微血管。组织标本以体积分数10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚度切片。采用免疫组化SP法染色，具体方法参照试剂盒(北京北瑞达医药科技有限公司)说明书进行。高倍镜下计数微血管数(Ⅷ因子相关抗原vWF多克隆抗体标记)。记录5个热点微血管数，取均数为最终MVD值。

1.4miR-126表达水平的测定采用实时荧光定量PCR法。使用Trizol常规方法提取组织标本RNA，经测定完整性和纯度后用于实验。依据武汉中帜生物科技有限公司提供的方法进行引物设计，茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT TCGCACTGGATACGACCGCATT，上游引物：5’-GGCTCGTACCGTGAGTAAT-3’，下游引物：5’-GTG CAGGGTCCGAGGT-3’，扩增产物长度462 bp。扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃延伸6 min。实时荧光定量PCR等操作按试剂盒说明进行，采用U6作参考基因，计算表达量。

1.5统计学处理应用SPSS 18.0处理数据。采用两独立样本的t检验比较2组大鼠心肌梗死组织MVD和miR-126的表达量；采用线性相关分析探讨瑞舒伐他汀组大鼠心肌梗死组织2指标的关系。 检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组大鼠心肌梗死组织MVD和miR-126表达水平的比较见表1。

表1 2组大鼠心肌梗死组织MVD和miR-126表达水平的比较

2.2瑞舒伐他汀组大鼠MVD和miR-126表达水平的相关性瑞舒伐他汀组大鼠心肌梗死组织MVD和miR-126的表达水平呈正相关(r=0.720,P=0.026)。

3 讨论

他汀类药物是一种3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，是目前临床上广泛应用的调整脂代谢紊乱的药物。Colakoglu和Elewa等[7-8]的研究显示，临床常规剂量的他汀药对缺血诱导的血管新生表现为促进作用，其机制可能与PI3K/Akt通路有关。张月兰等[9]研究发现，给予匹他伐他汀治疗14 d后，大鼠缺血后肢新生血管密度较对照组显著升高。Kikuchi等[10]发现匹他伐他汀可以通过影响Notch1的表达促进血管新生。Ma等[11]还发现他汀类药物对血管新生的影响还具有组织特异性。王东伟等[12]还发现大剂量瑞舒伐他汀可控制炎症反应。

已知miRNA在心血管系统中高度表达和特异表达，其在冠心病的发病和治疗中起重要作用。miR-126也是最新发现的促进心肌梗死后血管再生的小分子RNA。在哺乳动物，miR-126起源于egfl-7基因的前体结构，miR-126和其宿主基因egfl-7的转录被转录因子Ets1调控[13]。egfl-7是一种分泌蛋白，调控新生血管内皮芽细胞的移动和定位。Harris等[14]首次阐述了miR-126主要在内皮细胞中表达，在肺、心脏和肝脏等血管高度丰富的组织中，miR-126的表达水平也很高。各种各样的血管生长因子如VEGF或FGF对于梗死后的血管生成起到一定的作用。miR-126作用于VEGF和FGF，增强了血管生成前的反应，通过抑制Spred-1(一种Ras/MAP激酶信号通路的细胞内抑制剂)的表达促进血管的生成[15]。该研究结果显示，瑞舒伐他汀能促进心肌梗死后梗死组织血管再生，上调miR-126的表达，且血管再生和miR-126的表达呈正相关，提示瑞舒伐他汀可能通过上调miR-126的表达促进心肌梗死大鼠梗死心肌组织的血管再生。

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