miR-106b对HeLa细胞顺铂化疗敏感性的影响*

饶玉梅，陈 刚，李留霞，李秀芳，余静丽

1)郑州大学第一附属医院妇产科 郑州 450052 2)华中科技大学附属同济医院妇产科 武汉 430030

以铂类为基础的化疗在宫颈癌的临床治疗中应用广泛，然而其化疗耐药仍是临床中急需解决的问题之一[1]。肿瘤化疗耐药涉及药物在体内及细胞内的转运、代谢、细胞的损伤与修复等多个方面。microRNA是一种只有21～25个碱基的非编码小RNA，广泛存在于自然界中，研究[2]显示其在多数人类恶性肿瘤中表达失调，参与细胞的增殖、分化和凋亡等的调节，也参与肿瘤细胞的化疗耐药。有报道[3-4]miR-106b在小细胞肺癌、前列腺癌等高表达，并影响它们的转移侵袭功能，而有关其对化疗耐药影响的报道较少，仅见其对睾丸癌顺铂(DDP)耐药影响的报道[5]。有研究[6]报道miR-106b在宫颈癌组织中高表达，但其对宫颈癌生物学行为的影响未见报道，为此，作者进行了如下研究，探讨miR-106b对宫颈癌HeLa细胞的DDP化疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1材料宫颈癌HeLa细胞(美国ATTC公司)，DMEM培养基(美国 Gibco公司)，小牛血清、脂质体2000(美国Life Technologies公司)，DDP、MTT(美国 Sigma 公司)，miR-106b抑制剂、miR-106b类似物及其相应的阴性对照(美国Dharmacon公司)，Twist1、PTEN、p-AKT(Ser473)、β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，miR-106b逆转录引物及实时定量PCR扩增引物、反转录试剂盒、TaqMan MicroRNA试剂盒、U6 snRNA (广州市锐博生物科技有限公司)。

1.2miR-106b抑制剂、类似物转染后HeLa细胞中miR-106b的表达将处于对数生长期的HeLa细胞接种于6孔板中。按照脂质体2000说明书进行阴性对照(抑制剂阴性对照组、类似物阴性对照组)，miR-106b抑制剂，miR-106b类似物的转染，并设置空白对照。转染6 h后换新培养基，继续培养24 h，用于后续实验。按照Trizol说明书抽提总RNA，应用反转录试剂盒，将总RNA反转录成cDNA，应用TaqMan MicroRNA试剂盒对合成的cDNA进行实时定量PCR反应，反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 15 s，40循环；以U6为内参照，每组设3个复孔。

1.3miR-106b抑制剂、类似物转染后细胞对不同浓度DDP敏感性的MTT法检测细胞培养及分组同1.2。将转染后的HeLa细胞以5×103个细胞/孔接种于96孔培养板中。24 h后加入浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0和15.0 μmol/L的DDP，每个浓度设3个复孔，培养48 h后加入MTT溶液(5 g/L)15 μL，继续培养4 h，弃上清，加入100 μL DMSO后振荡20 min，在酶联免疫检测仪上测定570 nm波长时各孔光密度值(D)。细胞存活率=D(实验孔)/D(未加DDP对照孔)×100%。

1.4细胞凋亡率的流式细胞仪检测细胞培养及分组同1.2。依据MTT的结果，选取10 μmol/L DDP作用于各组细胞，然后常规收集细胞，PBS洗1次，按照Annexin-PI凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.5细胞中目的蛋白表达的Westernblot检测收获对数生长期空白对照、转染miR-106b抑制剂、类似物及阴性对照的细胞，加入100 μL预冷的细胞裂解液30 min，10 000g4 ℃下离心收集上清，二喹啉甲酸法测定提取蛋白的浓度。取100 μg总蛋白进行电泳，电转仪转至PVDF膜上；37 ℃、50 g/L脱脂奶封闭1 h，加入Twist1(1100稀释)、PTEN(11 000稀释)、p-AKT(Ser473) (11 000稀释)、β-actin(11 000稀释)一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入相应的碱性磷酸酶标记的二抗，常温孵育1 h，最后NBT/BCIP显色拍照。以目的蛋白与β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达量。

1.6统计学处理采用SPSS 13.0进行数据分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组细胞中miR-106b表达、细胞存活率、凋亡率以及Twist1、PTEN、p-AKT(Ser473)蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组HeLa细胞中miR-106b的表达结果见表1。

表1 miR-106b抑制剂、类似物转染后各组细胞中miR-106b的表达

F=5 308.285，P<0.001；*：与相应的阴性对照组及空白对照组相比，P<0.05。

2.2不同浓度DDP作用48h后各组细胞存活率的变化见表2。与对照组相比，不同浓度DDP作用下，转染miR-106b抑制剂后HeLa细胞的存活率下降，而转染miR-106b类似物后HeLa细胞的存活率明显上升。

2.3 10μmol/LDDP作用下各组细胞凋亡率的比较见表3。与对照组相比，miR-106b抑制剂可以促进细胞凋亡，miR-106b类似物可以抑制细胞凋亡。

2.4各组细胞中Twist1、PTEN、p-AKT(Ser473)蛋白的表达见图1、表4。转染miR-106b抑制剂后细胞中PTEN蛋白表达升高，Twist1、p-AKT蛋白表达降低；转染miR-106b类似物后PTEN蛋白表达降低，Twist1、p-AKT蛋白表达增强。

表2 不同浓度DDP作用48 h后各组细胞存活率的变化 (n=3) %

*：与相应的阴性对照组及空白对照组相比，P<0.05。

表3 10 μmol/L DDP作用下各组凋亡率的比较 %

F=70.807，P<0.001；*：与相应的阴性对照组及空白对照组相比，P<0.05。

表4 各组细胞中PTEN、Twist1、p-AKT(Ser473)蛋白的表达 (n=3)

*:与相应的阴性对照组及空白对照组相比，P<0.05。

图1 各组细胞中PTEN、Twist1、p-AKT(Ser473)蛋白的表达

3 讨论

miR-106b的编码基因定位于染色体7q22.1，其在宫颈癌组织中高表达[6]，且其表达还受人乳头瘤状病毒(HPV)的E6、E7蛋白的调节[7]，而HPV是宫颈癌的致病因素[8]，因此推测其在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用。作者将miR-106b的抑制剂及类似物转染HeLa细胞，MTT实验显示，当抑制miR-106b表达时，HeLa细胞对DDP的敏感性增强；而过表达miR-106b时，HeLa细胞对DDP的敏感性下降；凋亡检测也显示了同样的结果。

有资料[9]显示，miR-106b通过调节TGF-β信号通路而发挥作用。作者的研究结果显示miR-106b可以影响Twist1、PTEN、p-AKT(Ser473)蛋白的表达。PTEN是一种很重要的抑癌基因，其可影响到肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移侵袭等多方面的功能[10]。当降低miR-106b的表达，可增强PTEN表达，降低p-AKT的表达；当增强miR-106b的表达时，得到相反的效果。因此作者推测，miR-106b可能通过影响PTEN/AKT信号通路，进而影响HeLa细胞对DDP的敏感性。

尽管Twist1是细胞上皮间充质转化的一个重要的特征分子，在肿瘤细胞侵袭转移中得到广泛的研究，但另有报道[11]显示，Twist1也影响骨肉瘤细胞对DDP的化疗敏感性，当增强Twist1的表达，骨肉瘤细胞对DDP的敏感性下降。作者的研究显示，当增强miR-106b的表达时，Twist1的表达增强；而降低miR-106b的表达时，得到相反的效果。作者的研究结果还显示增强miR-106b表达，HeLa细胞对DDP的敏感性下降；降低miR-106b表达可增强HeLa细胞对DDP的敏感性。因此作者推测，miR-106b可能通过改变Twist1的表达，影响HeLa细胞对DDP的敏感性。这为miR-106b调控肿瘤细胞对DDP的敏感性的机制研究提供了一个全新的观点。

综上所述，miR-106b在宫颈癌HeLa细胞中高表达，其可能通过影响PTEN/AKT信号通路及Twist1的表达来调节HeLa细胞对DDP的敏感性。当然，以上实验均为体外实验，其最终需要体内实验进一步验证。鉴于miRNA上、下游调控分子的网络化、复杂化，miR-106b上游及下游调控分子的研究将是今后作者进一步研究的重点。

[1]Smith B, Cohn DE, Clements A, et al. Is the progression free survival advantage of concurrent gemcitabine plus cisplatin and radiation followed by adjuvant gemcitabine and cisplatin in patients with advanced cervical cancer worth the additional cost? A cost-effectiveness analysis[J]. Gynecol Oncol，2013 May 26.[Epub ahead of print]

[2]Cortes-Sempere M, Ibanez de Caceres I. microRNAs as novel epigenetic biomarkers for human cancer[J]. Clin Transl Oncol, 2011, 13(6): 357

[3]Savita U, Karunagaran D. MicroRNA-106b-25 cluster targets beta-TRCP2, increases the expression of Snail and enhances cell migration and invasion in H1299 (non small cell lung cancer) cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 434(4): 841

[4]Hudson RS, Yi M, Esposito D, et al. MicroRNA-106b-25 cluster expression is associated with early disease recurrence and targets caspase-7 and focal adhesion in human prostate cancer[J]. Oncogene, 2012 Sep 17.[Epub ahead of print]

[5]Koster R, di Pietro A, Timmer-Bosscha H, et al. Cytoplasmic p21 expression levels determine cisplatin resistance in human testicular cancer[J]. J Clin Invest, 2010, 120(10): 3594

[6]Ma D, Zhang YY, Guo YL, et al. Profiling of microRNA-mRNA reveals roles of microRNAs in cervical cancer[J]. Chin Med J (Engl), 2012, 125(23): 4270

[7]Zheng ZM, Wang X. Regulation of cellular miRNA expression by human papillomaviruses[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1809(11/12): 668

[8]刘洁,平静,常正义,等.DNA定量分析及HR-HPV检测在宫颈病变筛查中的价值[J]. 郑州大学学报：医学版，2012, 47(3):356

[9]Smith AL, Iwanaga R, Drasin DJ, et al. The miR-106b-25 cluster targets Smad7, activates TGF-beta signaling, and induces EMT and tumor initiating cell characteristics downstream of Six1 in human breast cancer[J]. Oncogene, 2012, 31(50): 5162

[10]黄丽艳，王娜，汤黎明，等.PTEN基因表达对EC9706细胞增殖、侵袭、凋亡能力的影响[J]. 郑州大学学报：医学版，2013,48(1):16

[11]Zhou Y,Zang X,Huang Z,et al.TWIST interacts with endothelin-1/endothelin A receptor signaling in osteosarcoma cell survival against cisplatin[J].Oncol Lett,2013,5(3):857