结直肠癌组织和结肠癌细胞中miR-31的表达及功能*

王朝杰，马 宁，周 云

河南省人民医院(郑州大学人民医院)肿瘤科 郑州 450003

2002年，Calin等[1]首先在慢性B淋巴细胞白血病中发现miR-15a和miR-16在68%的患者中缺失或表达下调，从此人们把microRNA和肿瘤联系起来。在随后的十余年里，microRNA和肿瘤发生、发展的研究逐渐深入，microRNA有可能成为肿瘤诊断的标志物和治疗的新靶点[2-3]。人miR-31首先在HeLa细胞中被发现，定位于染色体9p21.3[4]。miR-31在结直肠癌组织中表达上调已被诸多实验[5-6]所证实。作者研究了结直肠癌组织中miR-31的表达，并对miR-31的功能进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1临床标本的收集及处理收集2011年10月至2012年6月在河南省人民医院诊治的98例结直肠腺癌患者的临床资料。男51例，女47例，年龄24～83(54.3±15.1)岁。入选病例术前未行放、化疗，无其他肿瘤病史。收集患者肿瘤标本及距离肿瘤边缘5 cm以上的正常结直肠黏膜组织(均经病理证实)标本，一部分保存于-80 ℃冰箱，备RNA提取，剩余部分用体积分数10%甲醛固定24 h,常规石蜡包埋、切片及HE染色，光镜下观察。98例中局部浸润T1+T2+T3 62例，T4 36例；12例有脉管浸润。高分化1例，中分化68例，低分化29例。TNM Ⅰ期16例，Ⅱ期29例，Ⅲ期48例，Ⅳ期5例。其中27例患者有血清癌胚抗原水平资料。

1.2组织中miR-31表达水平的测定取约50 mg组织，剪碎，Trizol(美国分子研究中心)法提取总RNA，-80 ℃保存。按照TaKaRa逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)逆转录生成cDNA，-20 ℃保存备用。miR-31逆转录茎环引物序列如下：5’-GTCGTATCCAGTGCTGGGTCCGAGTGATTCGCACTG GATACGACCAGCTA-3’(Invitrogen上海生物有限公司)。内参基因5S rRNA应用随机引物(TaKaRa)进行逆转录。根据表1引物及探针序列行PCR扩增。PCR反应体系如下：10×Mg2+free PCR Buffer3.0 μL，25 mmol/L MgCl23.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 3.6 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，10 μmol/LTaqMan探针1.0 μL，5×106U/L的Taq酶0.3 μL，ddH2O 17.1 μL，cDNA 1.0 μL。阴性对照用ddH2O代替cDNA。实时荧光定量PCR反应程序如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性20 s，55 ℃退火25 s，60 ℃延伸35 s，40个循环。目的基因的表达量：R=E目的ΔCT目的/E内参ΔCT内参。R表示经内参基因标准化后，肿瘤组织相对于正常结肠黏膜组织目的基因的变化倍数。R>1.0表示肿瘤组织目的基因表达上调，<1.0表示目的基因表达下调。E表示扩增效率;ΔCT表示对照黏膜与肿瘤组织中目的基因的Ct值之差。

表1 miR-31及内参5S rRNA的PCR引物及探针序列

1.3细胞实验

1.3.1 细胞培养 人结肠癌细胞系HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-(瑞典林雪平大学肿瘤中心惠赠)在McCoy’s 5A 培养液 (瑞典Sigma-Aldrich公司) 中培养，其中添加体积分数10%胎牛血清及体积分数1% PEST和1.5 mmol/L的L-glutamine (美国Invitrogen公司)。

1.3.2 转染前后miR-31表达水平的测定 以2×103个/孔接种细胞于96孔板，按照转染试剂盒siPORTTMNeoFXTM(美国Applied Biosystems) 的操作说明操作，转染终浓度为100 nmol/L的Anti-miRTMmiR-31 抑制剂(anti-miR-31)或Anti-miRTM阴性对照(美国Applied Biosystems)。同1.2方法采用实时荧光定量PCR测miR-31的表达，结果用REST处理。

1.3.3 转染前后细胞增殖检测 以2×103个/孔接种细胞于96孔板，分别转染100 nmol/L anti-miR-31或阴性对照。转染24、48、72、96 h后，每孔加入5 g/L的MTT各20 μL，37 ℃孵育4 h后，加入二甲基亚砜150 μL/孔，振荡10 min，在490 nm下读取吸光度值。

1.3.4 转染前后细胞周期分析 24孔板每孔接种2.7×104个细胞，分别转染100 nmol/L anti-miR-31或阴性对照，48 h后消化细胞，PI染色，用FACScan (美国Becton-Dickinsson)行流式分析，数据应用ModFit LT for Mac V 3.1软件进行分析。

1.3.5 细胞迁移实验 采用QCMTM24孔细胞迁移实验 (美国Millipore Corporation)，按照说明书要求进行。主要步骤如下：细胞转染24 h后，在无血清培养基中饥饿培养12 h。收集细胞，4×104个细胞悬浮于300 μL无血清培养基中，种植于上室内。下室内加入500 μL含体积分数10%胎牛血清的培养基。16 h后，小心吸去上室内的培养液及细胞，并用棉签小心擦去膜上面尚未迁移的细胞，膜下面的细胞即为发生迁移的细胞。染色后每个膜选择5个有代表性的视野进行照相并计数，记录穿膜细胞数。

1.4统计学处理实时荧光定量PCR所得数据经对数转化后作为miR-31的相对表达量。miR-31在肿瘤组织中的整体相对表达变化及细胞转染前后miR-31的变化测定用REST分析(http://www.wzw.tum.de/gene-quantification)。应用SPSS 11.5处理数据，采用两独立样本的t检验比较结直肠癌患者miR-31的相对表达量和临床病理指标的关系；采用2×4析因设计的方差分析观察转染anti-miR-31不同时间对HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞增殖的影响，采用两独立样本的t检验比较转染anti-miR-31对细胞周期分布及迁移能力的影响，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1结直肠癌组织中miR-31的表达98例结直肠癌组织中，89例(91%)miR-31的表达上调，REST分析表明结直肠癌组织中miR-31的表达升高，是正常黏膜的15倍(P=0.001)。miR-31的表达与结直肠癌患者各指标的关系见表2。

2.2anti-miR-31转染对2种HCT-116细胞miR-31表达水平的影响实时荧光定量PCR结果显示，在HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞中，转染后miR-31的水平分别是转染前的44.1%和67.8%(P=0.042和0.046)。

2.3anti-miR-31转染对2种HCT-116细胞增殖的影响见表3、4。anti-miR-31转染对细胞增殖无明显影响(P>0.05)。

2.4anti-miR-31转染对2种HCT-116细胞周期分布的影响见表5、6。anti-miR-31转染对细胞周期分布无明显影响(P>0.05)。

表2 miR-31的表达和结直肠癌患者各指标的关系

表3 anti-miR-31转染对HCT-116p53+/+细胞增殖的影响 (n=3)

F转染=0.112，P=0.743；F时间=162.187，P<0.001；F交互=0.072，P=0.974。

表4 anti-miR-31转染对HCT-116p53-/-细胞增殖的影响 (n=3)

F转染=0.616，P=0.444；F时间=214.951，P<0.001；F交互=0.327，P=0.806。

表5 anti-miR-31转染对HCT-116p53+/+细胞周期分布的影响 (n=3) %

表6 anti-miR-31转染对HCT-116p53-/-细胞周期分布的影响 (n=3) %

2.5anti-miR-31转染对2种HCT-116细胞迁移能力的影响见图1、表7。anti-miR-31转染可以明显降低细胞的迁移能力。

图1 anti-miR-31转染对2种HCT-116细胞迁移能力的影响(苏木素,×400)

表7 anti-miR-31转染对2种细胞迁移能力的影响

3 讨论

炎症性肠病患者结直肠癌的发病风险明显升高，从非炎症到炎症，再到不典型增生，直至最后癌变，miR-31的表达水平呈逐渐升高的趋势[7]。该研究结果显示结直肠癌组织中miR-31的表达水平是正常黏膜组织的15倍，提示miR-31高表达与结直肠癌的发生有关。

Bandrés等[8]在小样本(10例)研究中发现，miR-31在结直肠腺癌Ⅳ期中的表达高于Ⅱ期；Schee等[9]在大样本(100例)研究中也发现了miR-31和结直肠腺癌肿瘤分期有关，而Slaby等[5]和Xu等[10]的研究中却未发现miR-31和结直肠癌肿瘤分期的关系。这种差异的产生除和研究者纳入的样本量大小有关外，还可能和各个实验室所使用的研究方法不一致有关。该研究结果显示miR-31的表达和结直肠癌TNM分期及肿瘤局部浸润有关，推测miR-31可能参与了结直肠癌的发展。

有研究[11]显示，在结肠癌细胞系LIM1863中，miR-31可抑制TIAM-1，进而调节结肠癌细胞的侵袭和迁移。该研究结果显示，应用anti-miR-31转染结肠癌细胞HCT-116后，细胞中miR-31的表达水平降低，然而细胞的增殖及细胞周期并未受到影响，细胞的迁移能力与转染前相比降低了50%左右，提示抑制miR-31的表达影响结肠癌细胞的侵袭和迁移能力。

总之，miR-31在结直肠癌组织中高表达，且和肿瘤的分期及局部浸润有关，抑制miR-31的表达可以抑制肿瘤细胞的迁移能力；miR-31有可能成为结直肠癌潜在的诊断指标和治疗靶点。

[1]Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(24):15524

[2]沈洁,冯常炜,郝炳章,等.血清中miR-21和let-7a在胃癌无创性诊断及手术效果评定中的作用[J].郑州大学学报：医学版,2012,47(5):722

[3]吴春蓉,罗治彬,陈伟.miR-451对结肠癌细胞系SW620生物学行为的影响[J].解放军医学杂志,2011,36(5):478

[4]Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, et al. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs [J]. Science, 2001, 294(5543):853

[5]Slaby O, Svoboda M, Fabian P, et al. Altered expression of miR-21, miR-31, miR-143 and miR-145 is related to clinicopathologic features of colorectal cancer[J]. Oncology, 2007, 72(5/6):397

[6]Motoyama K, Inoue H, Takatsuno Y, et al. Over- and under-expressed microRNAs in human colorectal cancer [J]. Int J Oncol, 2009, 34(4):1069

[7]Olaru AV, Selaru FM, Mori Y, et al. Dynamic changes in the expression of microRNA-31 during inflammatory bowel disease-associated neoplastic transformation [J]. Inflamm Bowel Dis, 2012，18(4):641

[8]Bandrés E, Cubedo E, Agirre X, et al. Identification by real-time PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed in colorectal cancer and non-tumoral tissues [J]. Mol Cancer, 2006, 5：29

[9]Schee K, Boye K, Abrahamsen TW,et al. Clinical relevance of microRNA miR-21, miR-31, miR-92a, miR-101, miR-106a and miR-145 in colorectal cancer [J]. BMC Cancer, 2012, 12: 505

[10]Xu XM, Qian JC, Deng ZL,et al. Expression of miR-21, miR-31, miR-96 and miR-135b is correlated with the clinical parameters of colorectal cancer [J]. Oncol Lett, 2012, 4(2):339

[11]Cottonham CL,Kaneko S,Xu L.miR-21 and miR-31 converge on TIAM1 to regulate migration and invasion of colon carcinoma cells [J].J Biol Chem,2010,285(46):35293