炎症性肠病小鼠外周血和结肠上皮组织中CD98蛋白的表达*

仝亚林，杨万荷，李家群，李治国，李林静，冯百岁

郑州大学第一附属医院消化内科 郑州 450052

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种病因和发病机制尚不清楚的肠道慢性非特异性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，该病在西方国家较为常见，但近年来我国IBD的发病率亦逐年升高[1-2]，成为医学界研究的热点及难点。近年来，免疫功能异常在IBD发病中的作用日益受到重视，但具体机制尚无明确定论[3-4]。CD98在胃肠道组织中高水平表达，可能是炎症发生和持续化的重要因素之一[5]。作者应用2,4,6三硝基苯磺酸(TNBS)诱发实验性小鼠IBD模型，分别采用流式细胞术和免疫组织化学染色方法检测小鼠外周血和结肠上皮组织中CD98蛋白的表达，探讨CD98与IBD发生发展的关系作用。

1 材料与方法

1.1实验动物、试剂和仪器SPF级雄性Balb/c小鼠48只，6～7周龄，体质量18～25 g，购自河南省实验动物中心。TNBS(Sigma公司)，FITC标记和未标记的山羊抗小鼠CD98单克隆抗体(Santa Cruz公司)，红细胞裂解液(北京鼎国生物科技有限公司)，流式细胞仪Epic-XLⅡ(美国 Beckmen Coulter公司)。

1.2实验分组小鼠随机分为正常对照组、生理盐水组、乙醇组和TNBS+乙醇组，每组12只。正常对照组：自由饮食，不进行干预。生理盐水组：禁食24 h，自由饮水，第1天100 μL生理盐水灌肠后自由饮食，于第8、15天重复此操作。乙醇组：用体积分数50%乙醇溶液100 μL灌肠，方法和步骤同生理盐水组。TNBS+乙醇组：第1天用2.0 mg TNBS加体积分数50%乙醇100 μL灌肠，第8天用2.5 mg TNBS加体积分数50%乙醇100 μL灌肠，第15天用3.0 mg TNBS加体积分数50%乙醇100 μL灌肠。TNBS+乙醇组小鼠在造模2～3 d时即出现少动、皮肤不光滑、体质量减轻、肛周皮毛被粪便污染、腹泻、便血等现象，并且以上现象可持续3周以上。

1.3取材实验第21天，水合氯醛腹腔注射麻醉，用摘眼球法取血后处死小鼠并留取距肛门约5 cm处的结肠标本，多聚甲醛固定，常规石蜡包埋。

1.4外周血CD98蛋白检测外周血样本加入红细胞裂解液，离心并洗涤后，分别再加入FITC标记的山羊抗小鼠CD98单克隆抗体，利用流式细胞仪进行检测。选用波长488 nm的氩离子激光，以“门技术”划定淋巴细胞，测定每个标本门内10 000个细胞。测定结果用Cellquest 3.0软件(美国Becton-Dickinson公司)进行荧光参数的获取和分析，记录CD98阳性细胞占外周血细胞的百分比。

1.5结肠上皮组织中CD98蛋白的表达采用免疫组化SABC法测定。取石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，滴加山羊抗小鼠CD98单克隆抗体(稀释100倍)。4 ℃冰箱过夜，次日加入生物素二抗，DAB显色，各步骤之间用PBS冲洗3次，每次5 min，依次脱水和封片,以PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性切片作阳性对照。均严格按试剂说明书步骤进行操作。结果判定：高倍镜(×400)下选择5个不重复视野观察。阳性细胞百分比：0～25%为0分，～50%为1分，～75%为2分，>75%为3分。染色强度：轻度计为1分，中度着色计为2分，重度着色为3分。阳性判断标准：以上两项得分之和≥3分为阳性，<3分为阴性。

1.6统计学处理采用SPSS 16.0处理数据，4组外周血CD98蛋白表达的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，结肠上皮组织中CD98蛋白表达的比较应用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组外周血CD98蛋白表达水平的比较见表1。

表1 4组外周血和结肠上皮组织中CD98蛋白表达水平的比较

*：与其他各组比较，P<0.05。

2.2 4组结肠上皮组织中CD98蛋白的表达见图1、表1。

图1 4组结肠上皮组织中CD98蛋白的表达(SABC，×400)

3 讨论

理想的动物模型是探究IBD病因、病理及药物研发不可或缺的重要工具。TNBS是一种半抗原，只有在与组织蛋白等大分子物质结合之后才能诱导免疫反应的发生，其在体内不能单独诱导免疫反应，因此造模时需要先用乙醇破坏肠道黏膜屏障，TNBS随之与肠道黏膜的角蛋白结合形成完全抗原，从而激发局部的免疫反应。用TNBS+乙醇诱导的小鼠实验性IBD模型是研究炎症性肠病的经典模型，灌肠后2～3 d即表现为急性炎症状态，3周左右进入慢性炎症阶段，其病理表现同临床上的炎症性肠病非常相似[4]。

目前认为，环境、遗传、感染及免疫因素共同参与IBD的发病，其中免疫因素在IBD发病中起着关键作用[6]。在对IBD发病机制的研究中,包括整合素在内的黏附分子参与的免疫反应和炎症过程是当前研究的热点之一[7]。CD98是一个发现和研究时间不长的白细胞分化抗原，是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，是由一条重链和一条轻链通过二硫键共价连接而成的异源二聚体[8]，可在除血小板以外的所有细胞表面表达，其序列和结构在不同物种进化过程中高度保守[9]。目前认为CD98有调节β1整合素、氨基酸转运及细胞融合与增殖等功能[10]。另外在维持肠道稳态及固有免疫应答中起着重要作用[11]，在肠道炎症的发生中也发挥着一定作用[12]。研究[13]发现，活化的CD98上调β1整合素的表达及其与胞外配合基的亲和力，引起细胞黏附增加。另外，CD98可以使β1整合素聚集为高密度的复合物，导致整合素活化[14]，产生整合素样信号传导，从而引发细胞的极性、黏附等特性的改变[15]，促进肠道炎症的发生和发展。

该研究结果显示，TNBS+乙醇组外周血CD98表达水平和结肠上皮组织中CD98蛋白的表达均较其他各组升高，提示CD98可能是IBD致病和炎症持续发生的重要因素。

综上所述，CD98可能参与了IBD的发病和病情进展。

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