冠心合剂对大鼠心肌梗死心功能、边缘区凋亡及对Fas、FasL 蛋白表达的影响*

郑 平 陈铁龙 祝光礼 赫小龙

（1.浙江省立同德医院，浙江 杭州 310000；2.浙江省杭州市中医院 浙江中医药大学附属广兴医院，浙江 杭州 310000）

心肌梗死后冠状动脉闭塞血流中断，部分心肌因严重而持久的缺血，导致了心肌细胞的不可逆的损伤、凋亡，是影响心肌梗死预后的主要原因。提高心肌的抗凋亡能力是目前防治心肌梗死的热点之一。冠心合剂可改善心肌血供，对缺血心肌有保护作用［1-2］。此研究通过观察冠心合剂对大鼠急性心肌梗死后心功能、凋亡及缺血边缘区凋亡蛋白Fas、FasL 蛋白质表达的影响，探讨其对缺血心肌保护的可能机制。

1 材料与仪器

1.1 动物 雄性SD 大鼠，体质量180～220 g，由浙江省实验动物中心提供。

1.2 药物与试剂 冠心合剂（组成：黄芪30 g，蒲黄20 g，五灵脂20 g），浓缩成2 g/mL的生药煎剂，由杭州市中医院制剂室提供。β-actin、Fas，caspase-8 和caspase-3 鼠单克隆抗体，FasL 兔多克隆抗体，购自美国Santa Cruze 生物技术公司。一抗稀释液、HRP 标记二抗，购自杭州达文生物有限公司。蛋白质定量试剂盒（BCA 法），购自北京普利莱基因技术有限公司。TUNEL 试剂盒，购自美国罗氏公司。

1.3 模型制备 80 只SD 大鼠随机分为5 组：冠心合剂大、中、小剂量组、对照组、模型组各16 只。冠心合剂各组于手术前7 d 开始灌胃，剂量分别为每日28 g/kg、14 g/kg、7 g/kg，对照组于相同时间给予灭菌蒸馏水2 mL/d 灌胃。大鼠麻醉后，连接实验动物呼吸机行正压呼吸。用6-0 号无创带针缝合线穿过左冠状动脉前降支，进针深度约为1～2 mm，结扎左冠状动脉前降支，造成急性心肌梗死模型，心电图出现ST 段明显弓背抬高提示造模成功。对照组不结扎冠状动脉。

1.4 指标检测

1.4.1 血流动力学检测 术后4 h 行血流动力学检测。麻醉后，分离右侧颈总动脉，三通管连接20 G 静脉鞘管和压力换能器，将压力传感器与Medlab-U/4CS 生物信号采集处理系统相连，测量并记录每只大鼠的左室内压峰值（LVSP）、左室等容收缩末期压力上升最大速度（+dp/dtmax），左室舒张末压力（LVEDP）、左室压力下降最大速度（-dp/dtmax）等参数。

1.4.2 原位末端标记（TUNEL）法各组取8 只大鼠，结扎部位以下左室心肌组织放入4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，按ROCHE 公司TUNEL 检测试剂盒说明书操作。每个石蜡块取6个切片，每张切片随机选取6个视野摄片，计数凋亡细胞数和细胞总数，图像用Image Pro Plus 6.0 软件分析。凋亡细胞定量计数单位以凋亡指数表示，凋亡指数=凋亡细胞数/总观察细胞数×100 %。

1.4.3 Western Blot 法 取大鼠左室梗死边缘区心肌组织标本液氮研碎，加入裂解液，经匀浆离心后，取上清液用BCA 法测定蛋白浓度，变性后-80℃保存。取各组样品50 μg，进行12% SDS-PAGE 并电转移至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉室温摇床封闭1.5 h 后，加入一抗稀释液稀释的Fas，FasL 抗体，孵育过夜，加入二抗（HRP 标记二抗，1∶1000 稀释），ECL 发光液显色，胶片扫描后用Image J 软件进行图像分析，以β-actin（1∶1000 稀释）作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量。

1.5 统计学处理 应用SPSS16.0 统计软件。计量资料以表示，在正态分布且方差齐的情况下对其行单因素方差分析，两两比较采用LSD 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况 对照组大鼠活动度好，反应灵敏，皮毛整齐、有光泽，饮食量正常。模型组大鼠动物活动度较差，反应迟钝，皮毛不整，无光泽，饮食量较少。冠心合剂各组大鼠活动度、反应灵敏度、皮毛光泽和饮食量较模型组均有不同程度改善，大剂量组大鼠接近对照组。

2.2 各组大鼠血流动力学指标比较 见表1。与模型组相比，冠心合剂大、中剂量组明显改善LVSP、+dp/dtmax、LVEDP 和-dp/dtmax（P＜0.05）。与对照组比较，冠心合剂大剂量组在LVSP 变化上差异无统计学意义（P＞0.05）。冠心合剂大、中剂量组在LVEDP 上无明显变化（P＞0.05），说明冠心合剂大 剂量 组改善LVSP 及LVEDP的程度接近对照组。冠心合剂各剂量组之间两两比较，大剂量组在改善+dp/dtmax和-dp/dtmax方面与小剂量组相比更加明显（P＜0.05），且存在LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax随冠心合剂剂量的提高而升高的趋势，LVEDP 随冠心合剂剂量的提高而降低的趋势，其中大剂 量 组的LVSP、+dp/dtmax、LVEDP 和-dp/dtmax改 善 最好，说明冠心合剂对心梗后大鼠血流动力学指标改善呈剂量依赖性，其中冠心合剂大剂量对血流动力学各指标改善程度较高。

2.3 冠心合剂对心梗大鼠凋亡的影响 见图1，表2。经原位末端标记标记后，对照组切片中检测到阴性细胞核染色呈蓝色，模型组切片中阳性细胞核染色呈棕褐色，细胞核体积缩小，或明显皱缩，形态多呈圆形。模型组切片心肌组织中可见大量阳性细胞核，凋亡指数明显增加，达（58.9±12.1）%，较对照组差异具有统计学意义（P＜0.05），冠心合剂组切片中阳性细胞核较少。冠心合剂大中小剂量组凋亡指数分别为（25.2±4.3）%，（32.9±6.5）%，（40.1±8.0）%，冠心合剂各剂量组凋亡指数明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；冠心合剂大剂量组降低凋亡指数的作用最为明显。

图1 各组大鼠缺血边缘区心肌组织TUNEL 染色（×200）

2.4 冠心合剂对心梗大鼠Fas 及FasL 蛋白表达的影响 见图2，表2。与对照组比，模型组Fas、FasL 蛋白表达明显升高（P＜0.01）。冠心合剂各剂量组Fas、FasL蛋白表达明显降低，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；其中冠心合剂大剂量组Fas、FasL 蛋白表达下降幅度最为明显。

表1 各组大鼠血流动力学指标比较（mmHg，±s）

表1 各组大鼠血流动力学指标比较（mmHg，±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

图2 冠心合剂对心梗大鼠Fas、FasL 蛋白表达的影响

表2 两组大鼠心梗面积、凋亡指数结果（%，±s）

表2 两组大鼠心梗面积、凋亡指数结果（%，±s）

表3 冠心合剂对心梗大鼠Fas 及FasL 蛋白表达的影响（±s）

表3 冠心合剂对心梗大鼠Fas 及FasL 蛋白表达的影响（±s）

3 讨论

急性心肌梗死后，心肌细胞凋亡或坏死，导致心肌部分区域活力心肌细胞减少或缺失，是心肌梗死临床各种表现的临床基础。心脏自身再生和修复能力均较弱的器官，对许多刺激都较敏感，尤其是缺血。目前认为心肌细胞是不可再生的，心肌梗死后心功能状态与心肌细胞数量密切相关。如何保护心肌，减少心肌细胞凋亡，对提高心功能，改善心肌梗死预后有非常重要的意义。Kajstura 等［3］研究结果认为凋亡是急性心肌梗死早期心肌细胞丢失的主要原因，大鼠冠状动脉阻塞后2 h 即可在梗死区检测到凋亡的心肌细胞，5 h 后凋亡细胞数量达高峰，随后逐渐减少。坏死心肌细胞数量则明显少于凋亡细胞，心肌细胞凋亡占梗死区所有细胞丢失的86%。TUNEL 染色［4］是一种快速和便捷的定量检测凋亡的手段，是目前公认的检测组织细胞凋亡的敏感方法，用于石蜡包埋的组织，实用性较好，可靠性高。笔者前期研究提示冠心合剂可能具有缺血心肌保护作用。本研究结果显示，与模型组相比，冠心合剂大、中剂量组明 显改善LVSP、+dp/dtmax、LVEDP 和-dp/dtmax，同时正常情况下心肌细胞凋亡非常少，心梗后缺血心肌的凋亡明显增加，冠心合剂各剂量组的心肌细胞凋亡均不同程度下降，其中冠心合剂大剂量组的凋亡指数最低，对心肌细胞凋亡的保护作用最明显。

心肌细胞凋亡由两条途径介导完成，一条是内源性途径，一条是外源性途径，或者同时由两条一起来完成。内源性途径又称为线粒体途径，外源性途径可以被FASL，肿瘤坏死因子-α 等触发［5］。Fas，又称CD95 是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，是由325个氨基酸组成的受体分子，Fas 一旦和配体FasL 结合，可通过Fas 分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。本研究结果提示，正常心肌Fas、FasL 蛋白表达水平较低，心梗后表达上升明显，冠心合剂各剂量组不同程度降低了Fas、FasL 蛋白的表达，其中冠心合剂大剂量组的Fas、FasL 蛋白表达水平最低［6］。

综上所述，冠心合剂可以提高心肌梗死后大鼠心功能指标，抑制梗死边缘区心肌细胞的凋亡、保护缺血心肌的作用，其机制与调节Fas/FasL 系统、降低Fas、FasL 蛋白的表达水平有关。然而，Fas/FasL 系统只是凋亡发生的一条信号传导途径，冠心合剂抑制凋亡的机制是否与其他信号传导途径有关尚待进一步研究。

［1］祝光礼，陈铁龙，陈启兰.黄芪失笑汤为主治疗气虚血瘀型冠心病［J］.浙江中西医结合杂志，2006，16（10）：625-626.

［2］祝光礼，周凡，陈铁龙.黄芪失笑散抗心肌缺血的实验研究［J］.中华中医药学刊，2007，26（11）：2232-2234.

［3］Kajstura J，Cheng W，Reiss K，et al.Apoptotic and necrotic myocyte cell deat hs are independent cont ributing variables of infarct size in rat s［J］.Lab Invest，1996，74（1）：86-107.

［4］张开，石玉秀.TUNEL 法-细胞凋亡的组织化学鉴定法［J］.日本医学介绍，1994，16（10）：469.

［5］Saraste A，Viopiopulkki LM，Parvinen M，et al.Apoptosis in the heart［J］.N Engl J Med，1997，336（16）：1025-1026.

［6］Whelan RS，Kaplinskiy V，Kitsis RN.Cell death in the pathogenesis of heart disease：mechanisms and significance［J］.Annu Rev Physiol，2010，72：19-44.