芪丹通脉片对心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生及HIF-1α、VEGF 表达的影响*

衣 慧 王俊超 司静文 张玉芬 王宗仁 李军昌△

（1.第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032；2.山东省寿光市中医院，山东 寿光 262700）

缺血性心脏病严重威胁着人类的健康，其发病率和死亡率近年来逐渐上升，其病理特点是心肌血管的狭窄或堵塞，导致心肌梗死。在中医学中缺血性心脏病属“胸痹”、“心痛”范畴，气虚血瘀，脉络不畅是其病机关键［1-2］。急性心梗发生后的再灌注疗法可恢复缺血组织的血供，有效地挽救缺血组织，但是，再灌注疗法受缺血组织血管再通时间的限制并存在再灌注损伤等问题［3］。本实验通过对心梗SD 大鼠模型应用芪丹通脉片（QDTMT）来观察心梗大鼠气虚血瘀表征、缺血心肌血管新生及缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）mRNA 及血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达，并探讨其可能机制。

1 材料和方法

1.1 动物 SD 大鼠80 只，雄性，体质量（230±20）g，该实验经第四军医大学伦理委员会批准，实验动物许可证号：No.0022401。

1.2 药物及仪器 QDTMT 提取浸膏干粉（药物组成为黄芪30 g，当归15 g，丹参30 g，红花30 g，桂枝10 g。1 g 干粉相当于2.86 g 生药）由第四军医大学西京医院中医科提供。小鼠抗大鼠CD31抗体（美国Abcam 公司）；小鼠抗大鼠免疫组化试剂盒（北京正四柏生物科技有限公司）；Trizol（Gibco 公司）；逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mix（日本TaKaRa 公司）；小动物呼吸机（BW-BM1103-200 型，上海软隆科技发展有限公司）；光学显微镜（尼康）；体式显微镜（Olymps）；超薄切片机（LEICA CM 1900）；RT-PCR 仪（BIO-RAD）。

1.3 造模与分组 雄性SD 大鼠腹腔注射30 g/L 戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，经口气管插管，连接小动物呼吸机。于左侧胸骨旁3、4 肋间打开胸腔，暴露心脏，以7-0 丝线结扎左冠状动脉前降支，待左室前壁变苍白时，说明MI 模型已建立成功。然后逐层关胸并排出胸腔气体。另设假手术（Sham）组18 只，只在相同部位穿线并不结扎，余步骤相同。待大鼠自主呼吸后撤去呼吸机。术后24 h 大鼠存活72 只，除Sham 组的18 只外，随机分为梗死组（MI 组）、MI+芪丹通脉片小剂量（MI+QDTMTL）组和MI+芪丹通脉片大剂量（MI+QDTMTH）组 各18 只，其 中MI+QDTMTL 组 给 予QDTMT 浸膏干粉0.36 g/kg，MI+QDTMTH 组3.24 g/kg，Sham 组和MI 组给予生理盐水3 mL/kg，QDTMT 浸膏干粉溶于生理盐水中各组等体积灌胃，每日灌胃1次。

1.4 动态观察（1）一般情况。4 周后观察大鼠精神状态、皮毛色泽、五官爪甲颜色及尾部特征等。（2）舌下脉络。实验第4 周时分别对各组大鼠进行30 g/L 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，用两根细线分别将大鼠的上下牙拉开后，用湿棉签轻触舌面，舌体伸出，并翻转显露舌下脉络，在自然光线下观察其舌色及舌底脉络。针对气虚血瘀证出现的青紫舌，主要从舌色和舌底静脉长度的两个方面拟定了量化评分标准。评分标准如下：正常舌—底色微青、舌静脉主干长度不超过舌体3/4，记为0 分；轻度紫暗—舌底色紫暗或舌静脉主干长度超过舌体3/4，记为1 分；明显紫暗—舌底色紫暗且舌静脉主干长度超过舌体3/4，记为2 分。

1.5 标本采集与检测 4 周后，称取大鼠体质量，腹腔注射30 g/L 戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，打开大鼠胸腔，充分暴露心脏，剪开右心耳用PBS 及40 g/L 多聚甲醛灌注，待心脏变白后取出心脏，每只大鼠沿结扎线向下取0.3 cm 厚心脏横断面组织1 块，40 g/L 多聚甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋，制作5 μm的石蜡切片。另，部分大鼠于第7日、14日及28日时心脏取材，打开胸腔后PBS 灌注，取下部分非梗死心肌组织放入预冷的Trizol 中，用于提取心肌总RNA。（1）检测心梗边缘区CD31的表达。采用小鼠抗大鼠免疫组化试剂盒进行免疫组化染色。石蜡切片常规脱蜡、入水、抗原修复；切片浸入3%H2O2中浸泡10 min，PBS 洗2 min×3次；加试剂A 封闭10 min，PBS 洗2 min×3次；加入1∶100 小鼠抗大鼠CD31 单克隆抗体，置于湿盒中4℃过夜。PBS 洗后加试剂B 孵育10 min，PBS 洗2 min×3次，再加试剂C 孵育10 min，PBS 洗2 min×3次；DAB显色；自来水充分冲洗后，复染，盐酸酒精分化，脱水、透明、封片、镜检。（2）测定各组大鼠心梗边缘区微血管数、微血管密度。心肌组织经CD31免疫组化染色后的切片，采用Weidner 法计数MVD［4］，经图像分析仪分析系统分析处理，先在40×的光镜视野下找到心梗边缘区血管密度最高的5个区域，然后在400×视野下计数血管高密度区血管数目，凡是染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数，管腔内径大于20 μm 或有较厚肌层（3 层以上）的则不予计数。每张切片随机选5个视野，计数MVC，取其平均值即平均微血管数目作为本例大鼠的MVC 值；用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文分析系统测定其阳性染色面积比（MVD），具体计算方法为MVD=MVC2/mm2。（3）心梗后7 d、14 d 和28 d，各组大鼠随即抽取6 只常规心脏取材，提取总RNA，用RT-PCR 方法检测各组大鼠HIF-1α 及VEGF mRNA的表达情况，①RNA 提取：按照Trizol的说明书提取心肌总RNA，并溶于50 μg DEPC 水处理水中。②RT 反应：取2 μg 总RNA，按照Super ScriptTMⅡRNase H-Reverse Transcriptase（Invitrogen 公司）的说明书反转录成cDNA。③PCR 反应：反应体系为20 μg。扩增HIF-1α 基因的引物序列：Forward：5'-CAGCAGACCCAGTTACAGAA-3'，Reverse：5'-TC AGTFAACTFGATCCAAAGCTCT-3'；VEGF 基因的引物序列：Forward：5'-TGCACCCACGACAGAAGGG-3'：Reverse：5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACAT-3'；扩增内参β-actin 基因的引物序列：Forward：5'-AGGTGACAGCATYGCTTCTG-3'；Reverse：5'-GCTGCCTCAA CACTCAAC-3'，引物均由北京赛百盛生物工程公司合成。按照TaKaLa 实时定量试剂盒加样，通过PCR 仪器进行检测，PCR的反应条件为：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40个循环。

1.6 统计学处理 应用GraphPad Prism5.0 统计软件。计量资料以表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，组间均值两两比较采用SNK 或Dunnett T3检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠气虚血瘀表征的变化

2.1.1 各组一般情况比较 见表1。

表1 各组一般情况比较

2.1.2 舌下脉络 Sham 组大鼠舌色淡红，舌下脉络清晰红润，舌象综合评分为0 分（93.33%）；MI 组大鼠舌色紫暗，舌下脉络扩张，青紫粗长，舌象综合评分以2分为主（80.00%）；MI+QDTMTL 组大鼠舌色暗红，舌下脉络较Sham 组增粗增长，舌象综合评分以1 分为主（66.67%）；MI+QDTMTH 组大鼠舌色红润，舌下脉络较Sham 组略增粗增长，舌象综合评分以1 分为主（86.67%）。

2.2 CD31单克隆抗体免疫组化染色结果 见图1。MI+QDTMTL 组和MI+QDTMTH 组CD31的表达较MI组增强，且MI+QDTMTH 组高于MI+QDTMTL 组。

2.3 各组大鼠心梗边缘区微血管数、微血管密度的比较 见表2。Sham 组、MI 组、MI+QDTMTL 组和MI+QDTMTH 组均可看到新生的微血管，但Sham 组微血管增生不明显，MI 组可看到少量的微血管增生，MI+QDTMTL 组可看到较多量的微血管增设，而MI+QDTMTH 组可见到大量的微血管增生。

图1 CD31单克隆抗体免疫组化染色结果（×200）

表2 各组大鼠心梗边缘区微血管数及微血管密度比较（±s）

表2 各组大鼠心梗边缘区微血管数及微血管密度比较（±s）

与Sham 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与MI 组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与MI+QDTMTL 组比较，▲P＜0.05。

2.4 芪丹通脉片对各组大鼠HIF-1α mRNA 及VEGF mRNA 表达的影响 见图2。结果如下：（1）7 d时，与Sham 组相比，其余各组HIF-1α mRNA 急剧升高（P＜0.01），以MI+QDTMTH 组表现最为明显；各组VEGF mRNA的表达也有所升高（P＜0.05）；（2）14 d时，除Sham 组外，各组HIF-1α mRNA的表达继续增高，与MI 组相比，MI+QDTMTL 组和MI+QDTMTH 组HIF-1α的表达有统计学差异（P＜0.01），且以MI+QDTMTH组增高更为显著；除Sham 组外，各组VEGF mRNA的表达有所降低，MI+QDTMTL 组和MI+QDTMTH 组同MI 相比仍然具有统计学差异（P＜0.05）；（3）28 d时，MI+QDTMTL 组和MI+QDTMTH 组HIF-1α mRNA的水平明显降低，与MI 组相比有统计学差异（P＜0.05 或0.01），VEGF mRNA的表达也有所降低，与MI 组相比具有统计学差异（P＜0.05）。

3 讨论

近年来，中医药在治疗性血管再生中的作用倍受关注［5］，益气活血法在缺血心肌治疗性血管再生中有着重要的指导意义。芪丹通脉片是在中医气血理论指导下，通过临床辨证而研制的复方中成药，已获得国家新药证书（国药证字Z20090035）和国家新药批准文号（国药准字Z20090252），既往实验证明其具有改善心肌缺血程度及减少心肌缺血范围的作用，并对急性心肌缺血危险因素高血脂、高血黏、冠心病、心绞痛有较好的治疗作用［6-7］，本实验结果表明，芪丹通脉片能够改善心梗大鼠气虚血瘀症状，促进梗死边缘区的血管新生，一定时间内能够上调HIF-1α 与VEGF mRNA的表达，且高剂量组比低剂量组疗效更加明显。

图2 大鼠心肌梗死后心肌组织中HIF-1αmRNA 及VEGF mRNA 水平的变化

HIF-1α 是在缺氧/缺血条件下，哺乳动物组织细胞产生的一种由HIF-1α 亚基和HIF-1β 亚基组成的核转录因子，HIF-1α 是HIF-1的活性亚基和氧调节亚基［8］，在非低氧细胞中几乎不表达，在缺氧条件下表达明显增加，而HIF-1β 几乎在所有细胞中广泛表达且不受氧张力的影响［9-10］。VEGF 是HIF-1α的下游靶基因，是内皮细胞特异性的促有丝分裂原，主要生物学功能是促进内皮细胞增殖、新生血管形成和增加血管通透性。HIF-1α 作为引发各种缺氧应激蛋白表达的转录因子，在缺血的适应性反应中起核心作用，它可以通过促进下游相关基因如VEGF 等的转录和表达，从而使机体对缺血、缺氧产生代偿性适应反应［11］。HIF-1α被认为是缺血环境血管新生的“发动机”［12-13］。在缺血心肌中稳定表达的HIF-1α 信号不仅能促细胞存活和血管新生，而且促进侧支循环的形成，且新生血管具有正常血管相似的结构，无血管渗漏现象［14］。局部注射稳定表达HIF-1α的腺病毒表达质粒后，可形成具有周围细胞包绕的出牙毛细血管。VEGF 是HIF-1α 介导的血管新生的关键下游因子［15］。然而，单独应用VEGF 刺激所形成的新生血管表现出形态不完整、存在渗漏现象［16］，这些研究表明HIF-1α 是缺血心肌治疗性血管新生与稳定的关键性转录调控因子。本实验研究结果表明大鼠心梗后1 周、2 周，心肌中HIF-1α 及VEGF表达升高，且芪丹通脉片治疗组要高于MI 组，4 周后，HIF-1α 及VEGF 表达相应下调，芪丹通脉片治疗组要低于MI 组，大剂量组低于小剂量组，笔者推测可能是芪丹通脉片能够促进能够活化HIF-1α 信号分子，上调HIF-1α 及VEGF的表达从而促进非梗死区血管新生，且呈剂量依赖性，随着新生血管生成后，心肌缺血缺氧得到改善，HIF-1α 及下游VEGF的表达又相应下调。

综上所述，HIF-1α 在缺血性心脏病治疗性血管新生与成熟过程中发挥着关键性作用，益气活血复方芪丹通脉片能够上调HIF-1α 下游的VEGF 来介导血管新生，通过活化HIF-1α 信号来影响新生血管的成熟与稳定，然而目前对HIF-1α 调控血管成熟的机制尚不明确，后期笔者将对这一现象展开研究。

［1］吴焕林，阮新民，杨小波.319例冠心病患者证候分布规律分析［J］.中国中西医结合杂志，2007，27（6）：498-501.

［2］何庆勇，王阶，张允岭，等.女性冠心病中医证候学及冠脉病变特点研究［J］.中国中西医结合杂志，2009，29（10）：879-882.

［3］杨来宝，温苑，马国超，等.中药早期干预对急性心肌梗死患者心功能的影响［J］.山西中医，2012，28（3）：11-13.

［4］Losodo DW，Isner JMl.Gene therap y f o rmyocardial angiogenesis［J］.Am Hreat J，1999，138：132.

［5］陈文元，吴立娅，陈 岩，等.中药影响血管新生作用机制研究进展［J］.中国中医基础医学杂志，2009，15（3）：237-239.

［6］王宗仁，郑瑾，马爱玲，等.中药芪丹通脉片对动脉粥样硬化大鼠主动脉内皮细胞及PAI-1 表达影响［J］.第四军医大学学报，2004，25（14）：1290-1293.

［7］李晶华，王宗仁，肖铁卉，等.芪丹通脉片预防异丙肾上腺素所致的大鼠慢性心肌缺血［J］.第四军医大学学报，2003，24（5）：397-399.

［8］Jiang BH，Zheng JZ，Leung SW，et al.Transactivation and inhibitory domains of hypoxia-inducible factor 1 alpha.Modulation of transcriptional activity by oxygen tension［J］.J Biol Chem，1997，272（31）：19253-19260.

［9］Zhao HX，Wang XL，Wang YH，et al.Attenuation of myocardial injury by postconditioning：role of hypoxia inducible factor-1α［J］.Basic Res Cardiol，2010，105（1）：109-118.

［10］Xie JJ，Liao YL，Yang L，et al.Ultrasound molecular imaging of angiogensis induced by mutant fbrms of hypoxia induced factor-1α［J］.Cardiovasc Res，2011，92（2）：256-266.

［11］Kido M，Du L，Sullivan CC，et al.Hypoxia-inducible factor 1alpha reduces infarction and attenuates progession of cardiac dysfunction after myocardial infarction in the mouse［J］.J Am Coll Cradiol，2005，46（11）：2116-2124.

［12］Pugh CW，Ratcliffe PJ.Regulation of angiogenesis by hypoxia：role of the HIF system［J］.Nat Med，2003，9（6）：677-684.

［13］Shohet RV，Garcia JA.Keeping the engine primed：HIF actors as key regulators of cardiac metabolism and angiogenesis during ischemia［J］.J Mol Med，2007，85（12）：1309-1315.

［14］Dou GR，Wang YC，Hu XB，et al.RBP-J，the transcription factor downstream of Notch receptors，is essential for the maintenance of vascular homeostasis in adult micel［J］.FASEB J，2008，22（5）：1606-1617.

［15］Dong H，Wang Q，Zhang Y，et al.Angiogenesis induced by hVEGF165 gene controlled by hypoxic response elements in rabbit ischemia myocardium［J］.Exp Biol Med（Maywood），2009，234（12）：1417-1424.

［16］Elson DA，Thurston G，Huang LE，et al.Induction of hypervascularity without leakage or inflammation in transgenic mice over expressing hypoxia-inducible factor-1α［J］.Genes Dev，2001，15：2520-2532.