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一颅锁骨发育不全综合征家族的RUNX2基因分析研究

2013-11-11姜涛蒋序张运奎

华西口腔医学杂志 2013年5期
关键词:基因突变

姜涛 蒋序 张运奎

[摘要] 目的 检测一个颅锁骨发育不全综合征(CCD)家系RUNX2基因突变情况。方法 采用先证者查证法,对CCD家系各成员进行全身健康状况及口腔专科检查,拍摄X线片;抽取先证者及其父母、姐姐外周静脉血,提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增RUNX2基因并测序,将先证者及其父母、姐姐RUNX2基因测序结果进行Blastn比较分析。结果 在先证者RUNX2基因的外显子2上发现了一个C→T突变,此突变来自母系染色体该基因568位点的基因突变;密码子CGG→TGG引起RUNX2编码的转录因子第190位保守的精氨酸变成色氨酸,突变型为c.568C>T。结论 c.568C>T突变是导致该家系发病的分子基础。

[关键词] 颅锁骨发育不全综合征; RUNX2; 基因突变

[中图分类号] R 781.6 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.019

颅锁骨发育不全综合征(cleidocranial dyspla-sia,CCD)是一种累及骨骼和牙齿的常染色体显性遗传性疾病[1],具有明显的家族聚集性,男女发病率无明显差别,临床发病率约为1:1 000 000。CCD常见的临床症状有囟门闭合延迟或不闭合,颅骨缝增宽,锁骨钙化不良、缺失或部分缺失,锥形胸,耻骨联合增宽而致骨盆发育不良,身材矮小等;口腔表现常见上颌骨发育不足,有多生牙,乳牙滞留,恒牙萌出延迟或埋伏牙等症状[2-5]。目前CCD的发病机制尚不清楚,本研究采用分子生物学的方法对1个颅锁骨发育不全家系的患者进行RUNX2基因测序分析研究。

1 材料和方法

1.1 研究对象

CCD家系1个,来自山东省济南市,家系图见图1。先证者,女,29岁,2010年6月因“牙齿不齐,咀嚼困难”到济南市口腔医院修复科就诊,要求修复上下牙列缺损。采用先证者查证法,对家系各成员进行全身健康状况及口腔专科检查。查体:先证者反,混合牙列,恒牙仅16、17、26、27、36、37、46萌出,全部乳牙均滞留,11~15、21~25、31~

35、41~45未萌,65、71、72、73、75、81、82、83、85松动Ⅱ度;颅骨和面部比例失调,头大面小,前额及顶部突出呈方形,前囟门未闭合,从额部到枕部中线区有明显凹陷;面中部发育不足,凹面型,眶距增宽;上颌骨及颧骨发育不足,下颌骨发育相对正常;肩部窄小,胸部呈圆锥形,锁骨短小,仅在近胸骨处可扪及,双肩下垂并可在胸前并拢。X线(图2)检查:上下颌骨内有埋伏牙,滞留乳牙牙根未见明显吸收,前囟门未闭合,颅缝增宽,并见多块缝间骨,双侧肩胛骨较小,呈翼状,位置下垂,双侧锁骨肩峰端部分缺如,耻骨联合间隙增宽,骶髂关节轻度增宽。先证者及其母亲的临床表现和X线特征均符合CCD特征。该家系中3代共15位成员,其中CCD患者2例:先证者及其母亲,其母亲自述先证者姥姥、姥爷和其兄弟姐妹无类似症状。

箭头所指为先证者,Ⅰ~Ⅳ代表代数。

图 1 患者家族谱系图

Fig 1 The pedigree of the involved family

1.2 基因组DNA提取及测序ⅡⅢ

1.2.1 DNA提取 抽取先证者及其父母、姐姐外周静脉血各2 mL,放入干冰冻存,使用Universal Ge-nomic DNA Extraction Kit试剂盒进行DNA 提取,取 1 μL进行琼脂糖凝胶电泳,获得基因组DNA。

1.2.2 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增 参照文献[6]的方法设计7对寡核苷酸引物(表1),然后对RUNX2 基因分别使用TaKaRa LA Taq?、TaKaRa MightyAmp DNA Polymerase?进行套式PCR 扩增,反应体系及方法按照说明书进行。

1.2.3 基因测序及突变位点分析 使用TaKaRa Aga-rose Gel DNA Purification Kit切胶回收目的片段进行测序,测序由宝生物工程(大连)有限公司完成,并对测序结果进行Blastn比较分析。

2 结果

将先证者的RUNX2基因测序结果进行Blastn比较分析,在Exon 2上发现了一个C→T突变,实际测序图谱显示双峰结构(C、T);对于其CCD母亲的基因检测结果表明,此突变来自母系染色体该基因568位点的基因突变;密码子CGG→TGG可能引起RUNX2编码的转录因子第190位(R190W)保守的精氨酸变成色氨酸。该突变型为c.568C>T,CGG>

TGG。先证者的父亲、姐姐的测序结果显示,在同一位点显示C的单峰,即与Blastn中健康人的序列相同(图3)。

3 讨论

目前的研究表明,颅锁骨发育不全的致病基因是RUNX2,该基因定位于染色体6p21[7-8],基因的错意表达、基因插入、缺失或者移码突变等都是造成颅锁骨发育不全综合征的重要原因[9]。

锁骨颅骨发育不全呈常染色体显性遗传,有很高的外显率和不同的表现型,轻症仅有牙齿异常,严重者表现为全身骨质受累[2]。本研究家系中母女两人受累,家系其他成员表型正常,考虑基因突变为突发性,突发后呈常染色体显性遗传。

锁骨颅骨发育不全的致病基因RUNX2是哺乳动物编码转录因子PEBP2/CBF异二聚体d亚单位的

3个基因之一,此α亚单位包含了有结合DNA能力的128个氨基酸残基,并且这一结构在进化中为保守区域,与果蝇的runt区域具有较高的同源性,因而得名[6]。

研究发现RUNX2基因敲除小鼠模型没有骨组织和成骨细胞,这表明该转录因子为成骨细胞分化所必需,其在维持正常的骨骼生长发育中起着重要的作用[10-11]。RUNX2基因突变存在热点区域,该基因外显子1、2、3、5、7编码蛋白质的3个重要功能域:谷氨酸-丙氨酸富集区(QA功能域)、runt功能域和脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸富集区(PST功能域)[12-14]。本研究检测到的R190W突变发生在RUNX2中,位于runt功能域内,这个碱基改变将导致位于runt 结构域中第190 位保守的精氨酸编码为色氨酸(R190W)。在runt区域中的精氨酸拉伸物对DNA的结合有重要作用,因此,这个区域的破坏可以导致DNA结合能力的丧失[13],精氨酸侧链是DNA结合的主要区域,当被不同的疏水性的色氨酸代替后,干扰了runt区域的结构,降低了DNA的结合能力。2001年Berg-witz等[15]首次报道了这个突变位点,本研究结果则进一步证实了RUNX2中的R190W错义突变为CCD的致病突变,推测R190W(c.568C>T)为一个突变热点。

典型CCD一般根据患者的典型面容、咬合关系、X线片检查以及全身情况即可诊断,X线检查方法为确诊本病的主要手段。由于CCD的X线征象具有特殊性,所以诊断并不困难,关键在于是否能想到本病。但对于轻症特别是仅有牙齿萌出异常患者的临床诊断较困难,通过检测RUNX2是否存在突变位点可以辅助诊断CCD。由于本病目前尚无确切有效的治疗手段且外显率高,即使检测基因发现有突变位点也并无好的治疗方法,因此CCD患者愿意进行抽血基因检测的比例很少。尽管目前已有80~90个RUNX2不同的突变位点被报道,约500个独立的CCD患者家族经过突变检测的筛选,但是此疾病致病基因的筛选和验证分析工作仍远远不够,新基因位点的鉴定将保证进一步的系统突变分析工作的开展,这可以为探讨CCD致病机制的分子遗传学机制打下坚实的基础。对于已经发现的CCD患者应进行遗传咨询,通过产前诊断及时发现携带有致病基因的胎儿[16]。

目前对CCD并无确切有效的治疗方法。对于处于生长发育期的患者可以采用正畸的方法进行治疗,必要时拔除滞留乳牙,减小恒牙萌出的阻力,或者采用牵引的办法帮助恒牙萌出;对于骨缺损导致的鼻梁塌陷等,可采用整形外科手术的方法进行骨移植,恢复患者的容貌;对于缺失牙齿,可采用种植或活动义齿等修复方法来进行修复。总之,对于CCD患者需要多学科联合修复治疗,长期的临床效果尚需要进一步观察。

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(本文编辑 李彩)

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