120例耐多药肺结核中医证候与基因突变的研究

黄颖新　潘景芝　汪洋　闫娜　孙集思

【摘 要】 目的：通过对耐多药肺结核中医证候与耐药基因突变的探讨，初步明确耐多药肺结核客观化指征。方法：选择120例耐多药肺结核患者，利用现代基因芯片检测技术，测定分枝杆菌对利福平、异烟肼耐药的基因突变位点，并分析比较其在各中医证候间出现的几率。 结果：利福平耐多药肺结核基因突变位点主要集中于rpoB-531（62.50%）和rpoB-526（19.17%）二个位点，其中在rpoB-531基因突变位点上，阴虚火旺证、气阴两虚证比肺阴亏虚证、阴阳两虚证发生率显著增高；在rpoB-526基因突变位点上，肺阴亏虚证比阴虚火旺证、气阴两虚证、阴阳两虚证发生率明显增高。异烟肼耐药基因在KatG315基因突变位点上，肺阴亏虚证比阴虚火旺证、气阴两虚证、阴阳两虚证发生率显著增高；在inhA15基因突变位点上，阴阳两虚证比肺阴亏虚证、阴虚火旺证、气阴两虚证发生率明显增高。结论：耐多药肺结核利福平耐药基因位点rpoB-526和/或KatG315突变可作为肺阴亏虚证的辨证指征，inhA15突变作为阴阳两虚证的辨证指征，rpoB-531突变可作为阴虚火旺证、气阴两虚证的辨证指征。

【关键词】 耐多药肺结核；中医证候；基因突变

【中图分类号】R259 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）06-0078-03

2007年我国被世卫组织列为全球25个耐多药结核病和严重耐多药结核病最优先控制的国家之一，且位居第一位。耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）和广泛耐药结核病（extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）已成为世界范围最为严重的流行疾病，其治疗费用多，治愈率低，死亡率高，是结核病控制所面临的最大难题[1]。证候是中医临床诊断和治疗的逻辑起点，是辨证论治的核心，加强揭示规律和本质的中医证候学研究具有重要的意义[2]。本研究选取120例耐多药肺结核病例，应用现代分子基因芯片检测技术分析利福平、异烟肼耐药基因突变位点与中医证候的关系，初步明确耐多药肺结核中医证候客观化指征，为提高辨证论治水平奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年1月至2014年12月住院及门诊耐多药结核病患者120例，其中男97例，女23例。年龄18～65岁，平均年龄（45.64±15.55）岁，病程3～600个月，平均病程（56.24±31.52）月。所有患者均符合《耐药结核病防治手册》[3]关于耐多药肺结核的诊断，以及国家中医药管理局颁布的《中医证候诊断标准》[4]、《中药新药临床研究指导原则》[5]等关于“肺痨（肺结核）”的诊断标准。排除标准：①罹患各系统重大疾病、长期服用免疫调节剂等可能干预中医证候判断的患者；②妊娠期或哺乳期妇女、精神病患者；③合并肺外结核病者。

1.2 中医证候诊断标准 ①肺阴亏虚证。主症：干咳，盗汗，手足心热；次症：痰中带血丝或血点，咳声短促，胸部隐隐作痛，口燥咽干，颧红，皮肤干灼；舌红少津，脉细或细数。②阴虚火旺证。主症：呛咳气急、午后潮热、盗汗；次症：时时咯血色鲜红，形体消瘦，五心烦热，骨蒸，失眠，颧红，口渴，胸胁掣痛，痰少质粘或痰黄稠量多，口燥咽干；舌红干，苔薄黄或见花剥苔，脉细数。③气阴两虚证。主症：气短声低、午后潮热、自汗与盗汗并见；次症：咳痰清稀、咳嗽无力，痰中夹血血色淡红，神疲乏力，畏风怕冷，纳呆，颧红，面色晄白；舌光淡，边有齿印，脉细弱而数。④阴阳两虚证。主症：形寒肢冷，自汗，盗汗；次症：潮热，五更泄泻，面浮肢肿，咳逆喘促少气，咯痰色白，痰中带血丝色暗淡，男子遗精，女子经少或经闭；舌质光淡甚者隐紫，少津，脉细数或虚大无力。以上以主症必备其中两项，次症兼具两项以上，综合舌、脉象即可诊断，均由三位副主任中医师以上职称专家共同进行判断。120例耐多药肺结核患者中肺阴亏虚证者11例，其中男9例，女2例，年龄20～64岁，平均年龄（44.09±16.18）岁，病程6～580个月，平均病程（57.18±30.96）月；阴虚火旺证者49例，其中男39例，女10例，年龄18～64岁，平均年龄（46.33±14.65）岁，病程3～590个月，平均病程（56.07±29.45）月；气阴两虚证者46例，其中男38例，女8例，年龄18～65岁，平均年龄（45.87±16.21）岁，病程5～600个月，平均病程（57.58±31.22）月；阴阳两虚证者14例，其中男11例，女3例，年龄19～65岁，平均年龄（46.23±15.34）岁，病程3～590个月，平均病程（57.41±32.15）月。各组患者男女比例，平均年龄以及平均病程等一般资料比较，差异均不具有统计学意义，组间具有可比性（P>0.05）。

1.3 基因芯片方法 选用Evidenceinvestigator-生物芯片仪（英国朗道实验诊断有限公司生产）。核酸提取：取 2ml痰标本于标本消化管内，加入NaOH-NALC 2ml。室温静置15min。提取1ml的标本处理液离心5min（12000r/min）共2次。向离心管内加入80μl核酸提取液，涡旋振荡混匀后移入核酸提取管。将核酸提取管于超声振荡器中震荡15min。待水浴锅温度达到 95℃以上后，将核酸提取管放入其中处理5min。取出后离心1min（12000r/min）。扩增：将PCR扩增试剂1、2、3分装扩增管中，18μl/管，每个管中加入2μl 模板DNA、阳性质控品或阴性质控品，做好标记。将扩增管放入扩增仪以下表的程序扩增。杂交：根据样品数目（n） 取2n个PCR管置于PCR架上，排成两排，同一列编排为一组，分别向PCR管内加入9μl杂交缓冲液；取出PCR产物，分别向列排管中加入反应体系一3μl，在上侧管内加入3μl对应体系二充分吸打混匀，在下侧管内加入3μl对应体系三充分吸打混匀，各反应体系共计15μl。将杂交混合物置于PCR仪上95℃加热5min，待其变性后立即放入冰水混合物中冰浴3min。吸取13.5μl杂交混合物加入杂交反应盒芯片点阵中，密封杂交盒。将杂交盒放入50℃预热20min的杂交仪中；50℃杂交2h，转速5r/min。读取：取出杂交反应盒组芯片，放入洗干仪进行洗涤甩干。将处理好的芯片放入扫描仪，读出结果。

1.4 观察指标 观察结核分枝杆菌对利福平、异烟肼耐药相关基因突变位点在中医各证候间出现的几率。

1.5 统计学处理 数据采用SPSS 12. 0软件进行统计学处理和分析，其中计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐多药肺结核利福平耐药基因位点与中医证候的相关性分析 利福平耐多药肺结核基因突变位点主要集中于rpoB-531（62.50%）和rpoB-526（19.17%）二个位点，其中在rpoB-531基因突变位点上，阴虚火旺证、气阴两虚证与肺阴亏虚证、阴阳两虚证比较，有显著统计学差异（P<0.05），说明阴虚火旺证、气阴两虚证与肺阴亏虚证、阴阳两虚证比较，其rpoB-531基因突变发生率显著增高，提示rpoB-531基因突变可作为阴虚火旺证和气阴两虚证的基因辨证特征之一；在rpoB-526基因突变位点上，肺阴亏虚证与阴虚火旺证、气阴两虚证、阴阳两虚证比较，有显著统计学差异（P<0.05），说明肺阴亏虚证与阴虚火旺证、气阴两虚证、阴阳两虚证比较，其rpoB-526基因突变发生率明显增高，提示rpoB-526基因突变可作为肺阴亏虚证的基因辨证特征之一。具体见表1。

2.2 耐多药肺结核中医证候不同位点基因突变发生率的比较 耐多药肺结核异烟肼耐药基因在KatG315基因突变位点上，肺阴亏虚证与阴虚火旺证、气阴两虚证、阴阳两虚证比较，统计学有极显著性差异（P<0.05），说明肺阴亏虚证与阴虚火旺证、气阴两虚证、阴阳两虚证等三型比较，其KatG315基因突变发生率更高，提示KatG315基因突变可作为肺阴亏虚证的基因辨证特征之一；在inhA15基因突变位点上，阴阳两虚证与肺阴亏虚证、阴虚火旺证、气阴两虚证比较，有极显著统计学差异（P<0.05），说明阴阳两虚证与肺阴亏虚证、阴虚火旺证、气阴两虚证比较，其inhA15基因突变发生率明显增高，提示inhA15基因突变可作为阴阳两虚证的基因辨证特征之一。具体见表2。

3 讨论

耐药结核病是指经体外药物敏感等试验证实，结核分枝杆菌对一种或多种抗结核化学治疗药物耐药，目前共分四大类：单耐药结核病、耐多药结核病、多耐药结核病以及广泛耐药结核病。耐多药结核病（简称MDR-TB）是指结核分枝菌经体外证实至少同时对利福平、异烟肼两种以上抗结核药物产生耐药。结核分枝杆菌发生耐药的机制包括靶结构基因突变、药物失活酶作用、细菌胞壁通透性改变和代谢途径改变等多种模式，而目前已证实的主要机制是由于菌内药物作用靶编码基因突变所致[6]。多项研究表明利福平的耐药发生与RNA聚合酶β亚基的编码基因rpoB突变密切，异烟肼的耐药发生与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因katG的缺失和突变及烯酰基还原酶编码基因inhA基因突变高度相关[7]。

基因芯片技术以其具有高通量、简便、微缩、平行化、集约化等方面的优点，中医药临床和研究领域如中医证候研究、中药药理学研究、中药有效成分筛选、中药毒性及不良反应研究等方面被广泛应用，在分子生物学与中医药学研究之间架起了一座技术桥梁，为中医药客观化和标准化研究提供了技术上的保障。结核分枝杆菌对抗结核化学治疗药物产生耐药的最主要机制为细菌菌体内药物作用靶编码基因的发生突变所致，利福平耐药的产生与结核菌RNA聚合酶β亚基的编码基因rpoB突变密切相关，异烟肼耐药与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因katG的缺失、突变及烯酰基还原酶编码基因inhA基因突变高度相关，因此，通过利用基因芯片耐药检测技术，探讨耐多药肺结核中医证候与利福平、异烟肼耐药基因突变位点之间相关性和内在联系，将有助于阐明基于基因水平的耐多药肺结核中医证候之本质。通过耐多药肺结核中医证候本质和规律的研究，将有助于了解其疾病的病因、病机，为临床辨证提供参考、证候标准的修订与完善提供依据。

本研究结果表明，利福平耐多药肺结核基因突变位点主要集中于rpoB-531和rpoB-526二个位点，其中在rpoB-531基因突变位点上，阴虚火旺证、气阴两虚证比肺阴亏

虚证、阴阳两虚证基因突变发生率显著增高；在rpoB-526基因突变位点上，肺阴亏虚证比阴虚火旺证、气阴两虚证、阴阳两虚证突变发生率明显增高。异烟肼耐药基因在KatG315基因突变位点上，肺阴亏虚证比阴虚火旺证、气阴两虚证、阴阳两虚证基因突变发生率显著增高；在inhA15基因突变位点上，阴阳两虚证比肺阴亏虚证、阴虚火旺证、气阴两虚证基因突变发生率明显增高。李桂莲等[8]分析了30株利福平耐药菌株的rpoB基因突变情况：总突变率为96.7%，其中rpoB 531突变率为70.0%，rpoB 526突变率为16.7%，利福平MIC≥32.00μg/ml与0.500～16.00μg/ml相比，菌株rpoB 531和rpoB 526基因位点的突变发生率高，推断rpoB基因突变与利福平高水平耐药有关。孙凤丹等[9]利用PCR-SSCP方法发现KatG菌耐异烟肼临床分离株是主要的基因突变类型，说明KatG在INH耐药中起主导作用，但某些菌株的耐异烟肼可能与KatG无关，而与inhA基因突变有关。因此，KatG基因突变是异烟肼耐药性的重要分子机制，inhA基因突变是重要的辅助机制。

综上所述，耐多药肺结核利福平耐药基因位点rpoB-526和/或KatG315突变可作为肺阴亏虚证的辨证指征，inhA15突变作为阴阳两虚证的辨证指征，rpoB-531突变可作为阴虚火旺证、气阴两虚证的辨证指征。

参考文献

[1]Huang Z， Qin C， Du J， et al. Evaluation of the microscopic observation drug susceptibility assay for the rapid detection of MDR-TB and XDR-TB in China： a prospective multicentre study[J]. J Antimicrob Chemother， 2015， 70（2）： 456-462. （ PMID： 25266071）

[2]周兴华，钟森，钟振东，等. 中医药辨证治疗肺结核证候规律研究[J]. 辽宁中医药大学学报，2012，14（11）：49-52.

[3]唐神结. 耐药结核病防治手册[M]. 北京：人民卫生出版社，2009，34-36.

[4]戴霞，郭伟星. 中医证候诊断标准规范化研究概况[J]. 中医杂志，2011，52（2）：168-171.

[5]郑筱萸. 中药新药临床研究指导原则[M]. 北京：中国医药科技出版社，2002，63-68.

[6]李桂莲，谢彤，巨韩芳，等. 天津市耐异烟肼或利福平的结核分枝杆菌相关基因突变特征[J]. 中华结核和呼吸杂志，2010，33（6）： 460-461.

[7]崔运勇，王峰，刘小立，等. 深圳市耐多药结核分枝杆菌流行株耐药基因序列分析[J]. 中国防痨杂志，2011，33（55）：257-262.

[8]李桂莲，张敬蕊，赵秀芹，等. 结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药水平与其耐药基因突变的相关性研究[J]. 中国防痨杂志，2012，34（6）： 354-359.

[9]孙凤丹，李月龙，韩忠波. 结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究[J]. 中国实用医学，2011，6（22）：102-103.

（收稿日期：2016.01.09）