含精氨酸的抗敏抛光膏对暴露牙本质表面变异链球菌黏附的影响

刘音辰　付东杰　黄翠　裴丹丹　孙华岭

[摘要] 目的 研究含精氨酸抗敏抛光膏对暴露牙本质表面变异链球菌黏附的影响。方法 暴露牙本质小管，使用浮石粉和抗敏抛光膏处理表面，观察其粗糙度的变化。体外培养变异链球菌，观察其在牙本质片表面黏附及葡糖基转移酶（GTFs）基因表达情况。结果 使用浮石粉及抗敏抛光膏均能有效降低表面粗糙度，抗敏抛光膏处理后的牙本质能明显抑制gtfB和gtfC基因的表达。结论 含精氨酸抗敏抛光膏能抑制变异链球菌黏附及gtfB和gtfC基因的表达，对敏感牙本质区域龋病发生具有一定防治作用。

[关键词] 精氨酸； 抛光膏； 黏附

[中图分类号] R 781.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.003

牙本质敏感是成年人常见的口腔疾病之一，主要表现为牙本质暴露引起的短而尖锐的疼痛[1]。暴露的牙本质易受到口腔环境中细菌及其毒素的侵袭，引起龋病、牙周病、牙髓炎等口腔疾病[2]。口腔细菌的黏附对于菌斑生物膜的形成至关重要，其黏附能力与致病性密切相关。口腔组织表面粗糙度、周围环境是影响细菌黏附的重要因素[3]。

目前市场上有一种含有8%精氨酸的抗敏抛光膏，可以有效封闭暴露的牙本质小管，具备较好的临床脱敏效果[4-5]。口腔链球菌能通过转氨基作用代谢精氨酸产生氨，改变周围环境pH值。因此，使用含精氨酸的抗敏抛光膏可能对变异链球菌在暴露牙本质表面的黏附产生影响。本实验选取变异链球菌这一主要致龋菌，来研究含精氨酸的抗敏抛光膏对暴露牙本质表面变异链球菌黏附的影响，进而探讨敏感牙暴露区域龋病防治的新思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

含精氨酸抗敏抛光膏（美国高露洁公司），800、1 200、1 500、1 800、2 000、3 000目水砂纸（武汉玉立砂带集团股份有限公司），牛心脑浸液（brain heart infusion，BHI）培养基（DB公司，美国），荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（大连宝生物工程有限公司），扫描电子显微镜（scanning electronic micros-cope，SEM）（Quanta 200，FEI公司，荷兰），实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司，美国）。

1.2 样本的制备和粗糙度分析

1.2.1 暴露牙本质样本的制备 收集18～25岁患者因正畸或阻生原因拔除的新鲜无龋第三磨牙，使用精密慢速切割锯沿牙冠长轴垂直方向切取牙冠中部的牙本质，每颗离体牙选取一个样本，加工成5 mm×

5 mm×1 mm的牙本质片，共27个样本。流水下逐级打磨抛光牙本质片，超声波清洗后，所有的样本在1%的柠檬酸中处理20 s，去除玷污层和开放牙本质小管，蒸馏水冲洗干净。由于表面处理不同，将样本分为3组，具体如下。1）抗敏抛光膏组：在牙本质片表面涂上充足的抗敏抛光膏，用橡皮杯低速抛光2次，每次30 s；2）浮石粉组：在牙本质片表面涂布足量直径为2 μm的浮石粉糊剂，用橡皮杯相同力度低速抛光2次，每次30 s；3）对照组：样本表面不做任何处理。所有样本均用蒸馏水冲洗干净，37 ℃蒸馏水中储存备用。

1.2.2 牙本质表面粗糙度的测量 每组各随机选取3个样本，在每个样本表面选取2个位点，用光学轮廓仪测量各组样本表面粗糙度（Ra）。

1.3 实验菌株

将复苏后的变异链球菌（UA159，ATCC#700610）接种于BHI中，在37 ℃厌氧条件下培养过夜。将对数生长期的细菌悬液在600 nm处的光密度（optical density，OD）值调整为0.35，然后用含1%蔗糖的BHI培养基稀释细菌悬液（1︰100）作为细菌黏附实验工作液。

1.4 细菌在暴露牙本质表面的黏附实验

将紫外照射消毒后的牙本质片置于24孔板中，每孔加入1 mL细菌生长培养液。37 ℃有氧条件下，细菌在暴露牙本质表面培养4 h后，每组各取3个样本，用PBS缓冲液冲洗去除未黏附的细菌，然后以2.5%戊二醛室温固定30 min，梯度脱水后喷金处理，置于SEM下观察细菌在牙本质片表面的黏附情况。

培养24 h后，每组另取3个样本，收集牙本质表面黏附的细菌。经过超声洗涤、溶菌酶去除细胞壁后，Trizol抽提、DNA酶Ⅰ消化去除基因组DNA等步骤获得细菌总RNA，用逆转录试剂盒反转录成cDNA，进行变异链球菌黏附相关基因——葡糖基转移酶（glucosyltransferases，GTFs）基因（gtfB、gtfC、gtfD）以及16S rRNA内参的荧光定量PCR扩增[6]，检测相关基因mRNA的表达。具体基因及引物序列见表1。

1.5 统计学分析

采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行处理，用单因素方差分析3组间黏附相关基因表达水平差异的显著性，并行两两比较的q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牙本质表面粗糙度

通过光学轮廓仪所绘制的3D图见图1。对照组表面高低不平，其粗糙度Ra值为（0.437±0.052） μm；浮石粉组表面较对照组光滑，其Ra值减小为（0.325±0.013） μm；抗敏抛光膏组牙本质表面最光滑，其粗糙度Ra值为（0.258±0.037）μm，明显低于对照组（P<0.05）。

2.2 变异链球菌在牙本质表面黏附的形态学观察

培养4 h后变异链球菌开始黏附于牙本质表面，对照组表面牙本质小管完全暴露，许多成团聚集的细菌黏附于小管周围，部分甚至进入至小管内部（图2）；浮石粉组牙本质小管有不同程度的堵塞，细菌呈链状分布，且数量较对照组明显减少（图2）；抗敏抛光膏组牙本质几乎完全堵塞，细菌分布更为分散，数量也最少（图2）。

2.3 细菌葡糖基转移酶基因mRNA的表达情况

将各样本及内参得到的Ct值代入标准曲线计算，得到变异链球菌黏附相关基因gtfB、gtfC、gtfD和内参16S rRNA的定量结果，然后把gtfB、gtfC、 gtfD的定量结果用相应样本的16S rRNA进行校正，再比较不同样品间的gtfB、gtfC、gtfD表达的相对定量。结果显示，培养24 h后3组样本间变异链球菌gtfB和gtfC的mRNA拷贝数之间均有显著差异（P<

0.05），而3组样本gtfD基因间差异无统计学意义 （P>0.05）（图3）。

图 3 3组gtfB、gtfC、gtfD基因的表达水平

Fig 3 Expression lever of gtfB， gtfC， gtfD of three groups

3 讨论

牙本质敏感区域通常存在牙本质暴露的情况，并且存在大量口腔细菌包围。致病菌及其代谢毒素很容易通过开放的牙本质进入牙本质甚至根管内，进而引起牙本质、牙周、牙髓和根尖周的细菌感染性疾病。目前治疗牙本质敏感的方法主要集中于敏感引起的疼痛的控制，而忽略了暴露牙本质龋病的关注。因此，有效防治暴露牙本质区域龋病的发生、发展是牙本质敏感患者不容忽视的问题。

早期黏附是细菌生物膜形成过程中非常重要的步骤，是生物膜发育和成熟的基础[7]。影响细菌在口腔组织黏附的因素很多，包括口腔组织及修复材料表面性能、细菌的生长环境等[8]。材料表面性能主要包含粗糙度、疏水性和表面自由能，尽管三者之间可以相互作用，但研究[9]证明粗糙度对细菌黏附的影响力大于自由能和疏水性。许多研究[10]也表明，粗糙的表面可促进细菌的黏附。本实验使用抛光膏及浮石粉处理暴露牙本质表面，SEM观察发现两种处理均能有效封闭牙本质小管，表面粗糙度也降低，进而抑制变异链球菌在牙本质表面的黏附。

变异链球菌是公认的主要致龋菌，能以蔗糖为原料，在GTFs作用下合成胞外多糖，从而促进细菌黏附和生物膜形成，因此GTFs被认为是龋病发生的关键[11]。变异链球菌的GTFs有3种（GTFB、GTFC、GTFD），对应3种编码基因（gtfB、gtfC、gtfD）。其中GTFB和GTFC合成水不溶性葡聚糖，与变异链球菌蔗糖依赖性黏附密切相关；GTFD合成水溶性葡聚糖，并非变异链球菌蔗糖依赖性黏附所必需[12]。变异链球菌gtfB、gtfC、gtfD基因的表达受到多种因素的调控，如碳水化合物营养源、环境pH值、细菌生长速度等[13]。本实验结果显示使用含精氨酸的抛光膏后，变异链球菌gtfB、gtfC基因表达水平显著降低，可能影响葡聚糖的合成，进而抑制变异链球菌在牙面的附着，从而影响菌斑的形成，减少了致病细菌的黏附数量，消除致龋的环境。这种现象的主要原因可能与精氨酸被口腔内多种链球菌代谢，通过转氨基作用产生氨，使得口腔环境pH值升高有关[14]。Koo等[15]证实gtfB和gtfC的基因位点相邻具有相同的调控机制，而gtfD的表达模式与gtfB和gtfC不同。这可能是抗敏抛光膏组gtfB和gtfC表达水平均明显降低，而gtfD表达却没有明显变化的原因。

本实验结果提示：使用含精氨酸抗敏抛光膏处理能显著降低变异链球菌gtfB和gtfC的表达，抑制变异链球菌在牙本质表面的黏附，对敏感牙本质区域龋病有一定防治作用。

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（本文编辑 杜冰）