鱿鱼肌肉组织细菌基因组DNA 提取方法的优化

王建玲，赵鹏程，邓弘毅，金 杨

(1.台州出入境检验检疫局，浙江 台州 318000;2.浙江师范大学，浙江 金华 321004)

鱿鱼，也称柔鱼、枪乌贼，营养价值很高，是广受欢迎的水产品之一。近20年来，随着远洋渔业的快速发展，我国鱿鱼产业也出现了跨越式发展。目前，全国鱿鱼产业企业已达到40 多家，鱿钓生产作业渔船达到480 多艘，鱿鱼捕获量达到42.8 万t，占全国海洋渔业产量的37.2%，占世界鱿鱼产量的50%。但由于冰鲜鱿鱼水分含量高，蛋白质丰富，且冰鲜鱿鱼在生产、加工、运输、贮藏等过程中往往会受到微生物的污染，导致冰鲜鱿鱼的货架期很短，进而引发一系列食品安全问题。

目前，我国对水产品中菌群多样性的研究大多仍用传统的分离培养法，但由于自然界中有85%～99%的微生物至今还不可培养，因此传统的分离培养法具有一定的局限性［1］。随着现代微生物分子生态学研究方法如变性梯度凝胶电泳 (DGGE)等的日趋成熟，研究者可以有效地避开传统的分离培养法，直接在分子水平上对水产品中菌群多样性进行研究。但利用分子生物学方法对菌群多样性进行研究时，首要解决的问题是菌群基因组DNA 的提取。常见的细菌基因组DNA 提取方法有十二烷基苯磺酸钠 (SDS)法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、溶菌酶法、超声波法或几种方法的组合。作者以SDS 法、CTAB 法和溶菌酶法为基础，采用两两结合的方法对鱿鱼组织中的细菌基因组DNA 进行提取，并比较了3种提取方法的优缺点，现将有关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜鱿鱼为购自金华市果蔬水产批发市场的冰鲜鱿鱼，无菌水洗涤，室温放置至出现轻度腐败味时进行取样分析。

1.2 鱿鱼肌肉组织中细菌总DNA 的提取

1.2.1 前处理

在无菌操作下将鱿鱼肌肉组织剪碎，称取3 份10 g 样品，置于无菌锥形瓶中，加入10 g 无菌玻璃珠和90 mL 无菌TE 缓冲液，200 r·min-1、4℃振荡处理30 min，静置5 min，取上清液50 mL，10 000 r·min-1离心10 min，用于细菌总DNA 的提取。

1.2.2 SDS 法结合CTAB 法

所得沉淀用10 mL TE 悬浮，加入0.5 mL 10%SDS，50 μL 20 mg·mL-1蛋白酶K，混匀，37℃孵育1 h。加入1.5 mL 5 mol·L-1NaCl，1.5 mL CTAB/NaCl 溶液，混匀，65℃孵育20 min。用等体积酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1)抽提，10 000 r·min-1离心10 min，取上清，重复上述操作直至两相交界面无白色物质出现为止。取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇 (24 ∶1)，10 000 r·min-1离心10 min。取上清，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置1 h，10 000 r·min-1离心15 min 得到DNA 沉淀。加入700 μL 75% 乙醇，70 μL 3 mol·L-1NaAc 漂洗DNA 沉淀后，溶解于1 mL TE，-20℃保存。

1.2.3 SDS 法结合溶菌酶法

所得沉淀用10 mL TE 悬浮，加入溶菌酶至终浓度10 mg·mL-1，加入0.5 mL 10% SDS，50 μL 20 mg·mL-1蛋白酶K，混匀，37℃孵育1 h。加入1.5 mL 5 mol-1NaCl，混匀，65℃孵育20 min。用等体积酚∶氯仿∶异戊醇 (25 ∶24 ∶1)抽提，10 000 r·min-1离心10 min，取上清，重复上述操作直至两相交界面无白色物质出现为止。取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇 (24∶1)，10 000 r·min-1离心10 min。取上清，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置1 h，10 000 r·min-1离心15 min 得到DNA 沉淀。加入700 μL 75%乙醇，70 μL 3 M NaAc漂洗DNA 沉淀后，溶解于1 mL TE，-20℃保存。

1.2.4 CTAB 法结合溶菌酶法

所得沉淀用10 mL TE 悬浮，加入溶菌酶至终浓度10 mg·mL-1，混匀，37℃孵育1 h。加入1.5 mL 5 mol·L-1NaCl，1.5 mL CTAB/NaCl 溶液，混匀，65℃孵育20 min。用等体积酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1)抽提，10 000 r·min-1离心10 min，取上清，重复上述操作直至两相交界面无白色物质出现为止。取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，10 000 r·min-1离心10 min。取上清，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置1 h，10 000 r·min-1离心15 min 得到DNA 沉淀。加入700 μL 75%乙醇，70 μL 3 mol·L-1NaAc 漂洗DNA 沉淀后，溶解于1 mL TE，-20℃保存。

1.3 DNA 样品纯度和浓度的检测

用Thermo Scientific NanoDrop ND-1000 微量分光光度计检测DNA 的纯度和浓度。

1.4 1 500 bp16S rDNA 片段的PCR 扩增

PCR 引 物:8F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’)和1510R (5’-GGCTACCTTGTTAC GA-3’)。

PCR 反应体系:Primer 1 μL，10×Ex Taq Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 5.0 μL，DNA 1.0 μL，TaKaRa Ex Taq 0.3 μL 和ddH2O 37.7 μL。

PCR 扩增程序:94℃预变性2 min;94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30个循环;最后72℃延伸2 min。

1.5 16S rDNA V3 区片段的PCR 扩增

PCR 引物:GC357F (5’-CGCCCGCCGCGCGC GGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGCCACCTACGGGAG GCAGCAG-3’)和517R (5’-ATTACCGCGGCTGC TGG-3’)。

PCR 反应体系:Primer 1 μL，2× GC Buffer II 25.0 μL，dNTP Mixture 8.0 μL，DNA 1.0 μL，TaKaRa La Taq 0.5 μL 和ddH2O 14.5 μL。

PCR 扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，305个循环;最后72℃延伸5 min。

1.6 DGGE 图谱的建立与分析

DGGE 电泳采用Muyzer 等［2］的方法，电泳条件为恒温60℃，电压85 V，聚丙烯酰胺凝胶的浓度8%，电泳时间14 h。电泳结束后，EB 染液浸染15 min，再用ddH2O 漂洗5 min，UVP 凝胶成像系统照相。

2 结果与分析

2.1 细菌总DNA 的提取

图1 表明，3种方法均能成功提取鱿鱼肌肉组织细菌的总DNA。其中，SDS 法结合CTAB 法和SDS 法结合溶菌酶法提取细菌总DNA 所得的DNA电泳条带亮度相似，CTAB 法结合溶菌酶法提取的DNA 电泳条带亮度最暗。

图1 3种方法提取的鱿鱼肌肉组织中细菌总DNA 的电泳结果

2.2 DNA 的纯度及浓度

纯度检测结果 (表1)表明，3种方法所提取的细菌基因组DNA 的D260/D280值1.81～1.91，D260/D230值2.28～2.37，说明所提DNA 纯度较高，可以直接用于进一步的PCR 扩增等实验。浓度检测结果表明，SDS 法结合CTAB 法和SDS 法结合溶菌酶法提取细菌总DNA 的浓度较高，CTAB 法结合溶菌酶法的提取的浓度较低。

表1 3种方法提取的鱿鱼肌肉组织细菌总DNA 的纯度及浓度

2.3 1 500 bp 16S rDNA 片段的PCR 扩增

以提取的鱿鱼肌肉组织细菌总DNA 为模板，以8F 和1510R 为引物进行第1 套PCR 扩增，结果如图2 所示，所得产物是大小约1 500 bp 的16S rDNA 片段。

图2 3种方法提取的鱿鱼肌肉组织中细菌总DNA 1 500 bp16S rDNA 片段的PCR 扩增结果

2.4 16S rDNA V3 区片段的PCR 扩增

以第1 套PCR 扩增产物为模板，以GC357F 和517R 为引物进行第2 套PCR 扩增，结果如图3 所示，所得产物是大小约160 bp 的片段。

图3 3种方法提取的鱿鱼肌肉组织中细菌总DNA 16S rDNA V3 区片段的PCR扩增结果

2.5 DGGE 图谱的建立

用第2 轮PCR 扩增产物在变性梯度30%～60%进行DGGE 电泳，结果如图4 所示。SDS 法结合CTAB 法所提取的细菌总DNA 的条带最多，为7条，SDS 法结合溶菌酶法和CTAB 法结合溶菌酶法相似，为6 条，但是SDS 法结合溶菌酶法的条带较CTAB 法结合溶菌酶法亮。

图4 3种方法提取的鱿鱼肌肉组织中细菌总DNA 16S rDNA V3 区的DGGE 图谱

3 小结与讨论

基于PCR 技术的分子方法是调查环境样品中微生物多样性的有效方法［3］，其中从样品中直接提取微生物总DNA 是分子生物学方法的关键步骤，常见的提取微生物总DNA 的方法有SDS 法、CTAB法、溶菌酶法等。SDS 是一种阴离子去垢剂，能裂解细胞，使核蛋白与核酸复合体分离，直接释放出DNA［4］。CTAB 是一种阳离子去污剂，能裂解细胞，并能与核酸形成复合物，这些复合物在低盐溶液中会因溶解度的降低而沉淀，而在高盐溶液中可解离，从而使DNA 和多糖分开［5］。溶菌酶是一类能溶解细菌细胞壁的酶，因此能达到裂解细胞的目的，该酶对革兰氏阳性菌具有较好的裂解作用，对部分革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌、伤寒沙门氏菌等，也具有一定的作用［6］。

本研究以3种提取方法为基础，采用两两结合的方法对鱿鱼组织中的细菌基因组DNA 的提取效果进行了比较。琼脂糖凝胶电泳和分光光度法对所提DNA 浓度检测结果表明SDS 法结合CTAB 法和SDS 法结合溶菌酶法所提取细菌总DNA 的量相近，均较CTAB 法结合溶菌酶法多，说明SDS 法结合CTAB 法和SDS 法结合溶菌酶法提取细菌总DNA的效果相似，CTAB 法结合溶菌酶法提取细菌总DNA 的效果最差。分光光度法和PCR 扩增实验对所提DNA 纯度检测的结果表明，3种方法所提取的细菌总DNA 纯度较高，无需纯化即可进行进一步PCR 扩增实验。

虽然DNA 提取质量的高低一般通过检测DNA的浓度与纯度来判断，但由于细菌总DNA 提取方法的不同可能会导致细菌裂解度的不同［7］，使得所释放的DNA 量不同，或因提取液中抑制剂残留水平不同，从而影响PCR 的特异性扩增［8］，最终引起样本中菌群多样性的缺失。DGGE 是目前研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一［9］，是一种能真实揭示样品中的微生物组成和动态变化的方法。DGGE 电泳结果表明，SDS 法结合CTAB法所提细菌总DNA 的条带最多，为7 条，SDS 法结合溶菌酶法和CTAB 法结合溶菌酶法相似，为6条，但是SDS 法结合溶菌酶法的条带较CTAB 法结合溶菌酶亮，说明SDS 法结合CTAB 法较另两种方法能更为真实地揭示待测样本中微生物的实际组成。

［1］辜运富，张小平，涂仕华.变性梯度凝胶电泳 (DGGE)技术在土壤微生物多样性研究中的应用［J］.土壤，2008，40 (3):344-350.

［2］Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA ［J］.Applied and environmental microbiology，1993，59 (3):695-700.

［3］Robe P，Nalin R，Capellano C，et al.Extraction of dna from soil ［J］.European Journal of Soil Biology，2003，39:183-190.

［4］刘华，申天琳，李学坤，等.土壤RNA 提取方法研究进展［J］.应用与环境生物学报，2011，17 (6):918-922.

［5］张宁，王凤山.DNA 提取方法进展［J］.中国海洋药物，2004 (2):40-46.

［6］戴清源，陈祥贵，李晓霞，等.溶菌酶的研究进展［J］.江西食品工业，2005 (2):33-34.

［7］Luo Peng，Hu Chaoqun，Zhang luping，et al.Effects of DNA extraction and universal primers on 16S rRNA gene-based DGGE analysis of a bacterial community from fish farming water［J］.Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2007，25(3):310-316.

［8］徐晓宇，闵航，刘和，等.土壤微生物总DNA 提取方法的比较［J］.农业生物技术学报，2005，13 (3):377-381.

［9］凌云，王辉，魏华，等.PCR-DGGE 技术在水产养殖中的应用及发展［J］.安徽农业科学，2010，38 (12):6244-6246.