新技术在鱼类胚胎冷冻保存中的应用

沈 蔷，章海敏，胡军祥

(浙江农林大学 动物科技学院，浙江 临安 311300)

目前全世界鱼类共有2.1 万余种，在9 000 余种淡水鱼类中，已有2%的种类灭绝;我国是一个水生生物资源丰富的国家，据统计大约有3 862种鱼类，其中淡水鱼类约有1 050种［1］，丰富的种质资源与遗传多样性为我国水产养殖业快速发展奠定了基础。但是，近年来，鱼类栖息环境污染、过度捕捞、水域面积缩减及外来入侵种的影响等，造成了某些鱼类资源的衰退和濒临灭绝。已有92种淡水鱼类被列为濒危物种［2］。另外，养殖业的快速发展导致养殖鱼类近亲繁殖越加严重，不合理引种，种质退化，遗传多样性锐减，个体小型化，对环境和病害的防御能力下降，病害发生日趋严重，已造成巨大的经济损失。因此，研究如何保护和利用好现有的水产种质资源和遗传多样性，实现我国水产养殖业的稳定和可持续发展是我国未来渔业科技发展的重点之一。

低温保存是通过低温抑制细胞代谢，使细胞由常温下的高能耗、强代谢状态，进入一种能量消耗、新陈代谢降至最低点的休眠状态。生物体内的化学反应在温度降低到-130℃时几乎会完全停止。如果降温方式合适，生物体系内部高度有序的结构状态不被打乱，蛋白质、酶以及其他细胞结构均未被破坏，复温后就能恢复活力［3］。根据这一原理，研究者对鱼类配子和胚胎低温保存进行了大量的探索，并已成功冻存了鱼类精子，为解决鱼类品种的异地异时杂交育种、珍稀鱼类繁殖、物种遗传物质的长期保存提供了可能性。在鱼类卵子和胚胎玻璃化冷冻保存方面，由于鱼类卵子具有体积大、双层卵膜、透水性差、含有大量卵黄物质等特点，同时由于鱼类生物学基础研究的缺乏和低温冷冻技术手段的局限性，尽管许多学者在冷冻保护剂毒性、细胞渗透性、降温方法等各方面进行了大量的研究，取得了一定的成绩，但目前仍未取得突破性的进展。本文综述近年来几种鱼类胚胎低温冷冻保存的成果、新技术及其研究进展。

1 鱼卵及胚胎冷冻保存

近年来，鱼类卵细胞和胚胎低温和超低温保存的研究引起人们的高度重视。尽管许多学者对鱼类胚胎的冷冻损伤机理［4］、适宜冷冻的胚胎发育阶段［5］、抗冻保护剂的种类和浓度［6］、冷冻降温方法［7］和解冻复活技术［8］等进行了大量实验研究，但目前尚未取得真正的突破。现将近年来在鱼类卵细胞和胚胎冷冻保存上取得的主要结果汇总于表1。

2 鱼类胚胎超低温冷冻

2.1 应用抗冻蛋白

一般抗冻剂对冷冻材料都有一定的毒性作用，且毒性随抗冻剂浓度的提高而增加。因此寻求一种既能够抑制冷冻溶液中冰晶形成，又不会对冷冻材料有毒性作用，或者毒性作用较小的新型抗冻剂非常必要。1969年，Devries 在南极Mcmurdo 海峡的一种Nototheneniid 鱼血液中首先发现了抗冻蛋白，经研究发现，抗冻蛋白是一类具有热滞效应、冰晶形态效应和重结晶抑制效应的蛋白质。迄今为止共发现5种抗冻蛋白，分别为抗冻糖蛋白(AFGPs)、Ⅰ型抗冻蛋白 (AFP Ⅰ)、Ⅱ型抗冻蛋白 (AFP Ⅱ)、Ⅲ型抗冻蛋白 (AFP Ⅲ)和Ⅳ型抗冻蛋白 (AFP Ⅳ)［16］。

表1 某些鱼类卵细胞及胚胎冷冻的保存成活率

Robles 等［17］研究发现，向金头鲷2 细胞期胚胎中显微注射抗冻蛋白能显著增加胚胎的低温耐受能力。Martínez-Páramo 等［18］在冷冻斑马鱼胚胎时，在抗冻剂中添加了1 mL 的AFP I (10 mg·mL-1)，使胚胎的存活率从30% 提高到了55%。因此，将化学抗冻剂和抗冻蛋白混合使用，不仅降低了化学抗冻剂的使用浓度，减小了对胚胎的毒性，同时提高了鱼类胚胎冷冻保存的存活率。

2.2 应用水通道蛋白

由于鱼卵的双层卵膜结构限制了水分和抗冻剂在膜两边的渗透，使抗冻剂难以渗透进入卵内，因此寻找一种改变膜通透性的方法至关重要。水通道蛋白 (aquaporin，AQPs)，最初由Agre 等于1988年偶然在红细胞膜上发现，称为形成通道的整合膜蛋白 (CHIP 28)，1991年，研究人员完成其cDNA克隆并进一步确定其为细胞膜上转运水的特异性通道蛋白，并称CHIP 28 为AQP 1。此后，陆续发现了水通道蛋白家族中的13个亚型 (AQP 0– AQP 12)。根据AQPs 的渗透特异性可将AQPs 分为2类:第1 类只对水有渗透性，如AQP 0-2、AQP 4-6、AQP 8 等;第2 类除转运水之外，还对其他小分子溶质有渗透性，尤其是甘油，包括AQP 3、AQP 7、AQP 9-10 等［19］。

Delgado 等［20］将AQP 3 的cRNA 注射到未成熟的青鳉卵细胞中进行表达，经培养后发现水的渗透性接近未注射的正常卵细胞的2 倍，Gly、EG、PG和DMSO 的渗透性均明显高于未注射的正常卵细胞，分别达到了 (2.20 ±1.29)×10-3，(2.98 ±0.36)×10-3，(3.93 ±1.70)×10-3，(3.11 ±0.74)×10-3cm·min-1，且经注射cRNA 后的未成熟卵细胞有51%发育成熟、发育成熟后有43%的卵细胞成功受精孵化。

2.3 显微注射技术

鱼类胚胎在冷冻保存过程中，内部的卵黄囊是鱼类胚胎冷敏感性的关键部位。卵黄囊内含有水分，冷冻过程中会产生冰晶对胚胎造成损伤，但由于卵黄被卵黄合胞体层所包围，卵黄合胞体层通透性差，阻碍了抗冻剂进入卵黄。因此有必要寻找一种方法来克服这一难点。

显微注射法最初应用于基因工程，后来Liu等［21］利用这一技术对斑马鱼的6 体节期胚胎进行了部分卵黄 (50%～75%)去除，低温冷冻后发现去除部分卵黄后，斑马鱼胚胎存活率及低温耐受性均显著提高。但是6 体节期胚胎在去除部分卵黄后出现了对部分冷冻保护剂 (如甲醇、丙二醇)的不渗透性。可见去除部分卵黄对降低鱼类胚胎冷冻的难度可能会具有一定的意义，但技术有待进一步突破。

Janik 等［22］率先将此方法应用到斑马鱼胚胎冷冻保存中，后来Beirão 等［23］将显微注射技术应用在金头鲷的低温冷冻中，并发现该技术可以对尾芽期胚胎使用更高浓度的冷冻保护剂，而不会对胚胎造成毒害，但是在改善胚胎冷敏感性方面并无显著影响。武鹏飞等［24］研究了显微注射抗冻剂种类、抗冻剂的注射剂量、注射浓度，以及抗冻剂注射后牙鲆胚胎的冷敏感性影响，发现抗冻剂毒性PVP ＞蔗糖，DMSO ＞MeOH ＞PG ＞PM (PG∶MeOH 体积比2 ∶1)，牙鲆胚胎较适宜的显微注射剂量为750 pL，且显微注射后胚胎的冷敏感性有一定的降低。

2.4 飞秒激光脉冲技术

显微注射技术使用的纳米针都是入侵式的，容易对胚胎内结构、相邻细胞以及卵膜等造成破坏。随着研究的深入，研究者发现飞秒激光技术可以有效地应用于生物学研究中。大多数细胞在近红外波段是透明的，因此近红外飞秒激光对细胞的穿透深度深，且当飞秒激光聚焦于透明材料时，聚焦处的光强非常高，足以引起非线性吸收，但聚焦处附近的热影响非常小，对邻近细胞几乎没有损坏。同时当激光束在膜上聚焦几毫秒时，产生了瞬态的小孔，由于细胞膜具有流动性，损伤的细胞膜会在短时间内得到修复，从而再次形成完整的屏障［25］。

Kohli 等［26］在对狗肾细胞的研究中发现，利用飞秒激光脉冲技术对细胞进行穿孔不会造成细胞崩解、气泡形成等细胞形态变化。同时将抗冻剂蔗糖通过瞬态小孔成功地渗透进狗肾细胞中［27］。之后又利用飞秒激光脉冲技术成功地将异硫氰酸荧光素、DNA (Simian-CMV-EGFP)等导入到斑马鱼的未去膜和去膜的胚胎中［28］。

2.5 超声波空化

超声波空化作用是指存在于液体中的微气核(空化泡)在声波的作用下振动，当声压达到一定值时发生的生长和崩溃的动力学过程。空化作用一般包括3个阶段，空化泡的形成、长大和剧烈的崩溃。时兰春等［29］指出稳态空化作用形成的空化泡可使其周围的酶或细胞颗粒受到微声流作用下的切应力作用，这可能导致细胞的破坏。但是低强度超声波产生的稳态空化作用对细胞的破坏很小，主要是改变细胞膜的渗透性，促进可逆渗透，加强物质运输，从而增加代谢活性和促进有益物质的生成。

Bart 等［30］认为超声波空化在提高胚胎甲醇渗透性上是物理损伤最小的方法。Silakes 等［31］研究了超声波对不同发育时期、不同去膜程度 (完全去膜、卵膜软化、未去膜)斑马鱼胚胎的甲醇渗透性影响，发现超声波处理能明显提高胚胎的甲醇渗透性，且90%外包期最高达到了 (85.3 ±8.1)μmol，但是仍远低于胚胎玻璃化所需浓度(10 mol·L-1)［32］。

3 展望

目前上述几种新技术在鱼类胚胎低温保存中的应用还不够广泛，但已经引起了许多低温工作者的浓厚兴趣，并取得了一些研究成果。但是这些技术仍存在一些问题，如水通道蛋白和超声波空化虽提高了胚胎对抗冻剂的渗透性，但仍远未到达胚胎玻璃化的最佳浓度;显微注射法容易对胚胎造成入侵式破坏;而飞秒激光技术还存在着价格高昂、仪器结构庞大、可操作性差等问题。相信随着科学技术的不断发展、各学科之间的相互交叉、各种新技术的不断研发、各类技术的不断结合，鱼类胚胎冷冻保存技术必将不断成熟与突破，其在水产养殖领域的前景一片光明。

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