慢性乙型肝炎患者血清M30 抗原浓度变化及其临床诊断价值

魏建波 姜 凯 王 伟

(浙江省立同德医院,浙江 杭州 310012)

肝细胞凋亡与很多慢性肝脏疾病相关[1-2],而在肝细胞发生凋亡的早期,细胞角蛋白18(CK18)在天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)的作用下发生断裂,生成一种能被M30 单克隆抗体特异性识别的表位,称之为M30 抗原[3],它只在凋亡的肝细胞内出现而不会出现在活的或坏死的肝细胞内[4]。近年来的研究发现在非酒精性脂肪肝和丙型肝炎患者血清中,M30 含量显著升高,且M30 能比血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸转移酶(AST)更为敏感地表征这两种疾病,这些表明了M30 抗原在肝脏疾病的研究中具有十分重要的价值。本文通过检测慢性乙肝感染者血清中的M30 抗原水平,探讨其作为一种新型的生物指标与乙肝病毒引起的肝损伤的相关性,以指导临床应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机收集本院2011年6月～2012年9月慢性乙肝感染者131例,根据HBV 感染者血清学、病毒学、生化试验,将对象分成3组：非活动HBsAg 携带者47例;HBeAg 阴性慢性乙肝(CHB)44例;HBeAg 阳性慢性乙肝(CHB)40例,诊断标准见参考文献[5]。健康对照组23例,为同期本院体检健康者。抽取患者新鲜血3mL,分离血清标本于-70℃中保藏备检。

1.2 方法 血清生化指标：应用日立7600 全自动生化分析仪,速率法测定受检者血清丙氨酸转移酶(ALT)、天门冬氨酸转移酶(AST)。血清HBV -DNA：应用ABI-7600PCR 仪实时荧光定量测定,所用试剂盒为上海之江生物乙肝DNA 试剂盒。M30抗原测定：按照M30-Apoptosense ELISA 试剂盒(Peviva AB,瑞典)说明书步骤,在450nm 处读取吸光值,与标准品对照计算血清中M30 抗原的水平。

1.3 统计学处理 全部数据均用SPSS19.0 软件进行统计学分析,正态分布的数据采用(±s)表示。不同组别M30 抗原比较采用单因素方差分析(进一步的两两比较用Newman-Keuls 法q 检验),M30 抗原与ALT、AST、血清DNA 浓度之间的关系用直线相关分析;评价M30 抗原诊断慢性乙肝工作效能用受试者工作曲线(ROC)分析。

2 结果

2.1 临床特点和血清M30 抗原检测结果 AST、ALT、血清乙肝DNA、M30 抗原在各组观察对象中有非常显著性差异(P＜0.01)。用q 检验比较M30 抗原水平在各组之间差异显示：M30 抗原在非活动HBsAg 携带者组(106.6±16.4)U/L 与健康对照组(101.1±13.6)U/L 无显著性差异(P＞0.05);非活动HBsAg 携带者M30 抗原浓度明显低于HBeAg 阴性CHB(177.9±20.1)U/L(P＜0.01)和HBeAg 阳性CHB (163.3±15.3)U/L(P＜0.01);HBeAg 阴性CHB组与HBeAg 阳性CHB组无显著性差异(P＞0.05),见表1。

2.2 慢性乙肝感染者血清M30 抗原与AST、ALT、血清乙肝DNA 相关性 所有131例乙肝感染者中,血清M30 抗原浓度与ALT、AST 之间存在着明显的正相关关系(r=0.567,r=0.457,均P＜0.01),但是与血清乙肝DNA 浓度没有明显的相关性(r=0.034,P＞0.05)。

2.3 慢性乙肝感染者血清M30 抗原和ALT ROC曲线 M30 抗原ROC 曲线下面积(AUC)为0.830(95%CI：0.752-0.893),以120U/L 为cutoff 点,M30抗原水平区分非活动HBsAg 携带者与慢性乙肝患者(CHB)灵敏度72%(95%CI：61%-85%),特异性81%(95%CI：69%-94%)。而ALT 的ROC 曲线下面积(AUC)为0.745(95%CI：0.687 -0.812),以45U/L 为cutoff 点,ALT 水平区分非活动HBsAg 携带者与慢性乙肝患者(CHB)灵敏度65%(95%CI：57%-73%),特异性73%(95%CI：62%-81%)。说明前者诊断慢性乙肝的价值明显高于后者,见图1。

2.4 HBeAg 阴性CHB 患者M30 抗原水平 比较非活动HBsAg 携带者组[n=47,(106.6±16.4)U/L]与ALT 正常(＜45 U/L)的HBeAg 阴性CHB[n=24,(144.6±13.4)U/L]M30 抗原水平,前者明显低于后者(P＜0.05),以120U/L 为cutoff 点,后者有62.5%(15/24)阳性。

表1 临床特点和血清M30 抗原检测结果(±s)

表1 临床特点和血清M30 抗原检测结果(±s)

注：a拷贝数的对数值

图1 131例乙肝感染者M30 抗原和ALT 的ROC 曲线

3 讨论

慢性乙肝感染者,分为非活动HBsAg 携带者和慢性乙肝患者。前者占据大多数[6],但是其中大约有20%～30%肝病毒自发性地重新活跃[7]。目前临床上,为了区分两者主要是定期检测患者血清ALT,但是ALT 仅能反映肝细胞的坏死情况,不能反映肝细胞的凋亡程度。而细胞凋亡是慢性乙肝患者肝细胞损伤的重要原因[1-2],凋亡细胞的原位检测方法如琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记技术需要进行肝脏活检,取材不易,危险性高,限制了其临床推广应用。

M30 抗原是细胞凋亡时释放入血的产物,取材容易且体外检测技术要求不高,所以本研究尝试用ELISA 试剂盒定量检测慢性乙肝感染者血清中M30抗原,结果发现无论HBeAg 阳性与否,慢性乙肝患者血清M30 抗原水平明显高于非活动HBsAg 携带者,而非活动HBsAg 携带者M30 抗原水平与正常对照组无差别,这表明M30 抗原在乙肝活动期时升高,同时凋亡可能不是非活动 HBsAg 携带者肝细胞损伤的主要方式。本文结果还显示M30 抗原水平与ALT、AST 呈正相关,提示M30 抗原浓度可反映肝细胞的损伤程度。

本观察对M30 抗原和ALT 来诊断慢性乙肝的价值作了ROC分析,结果显示M30 抗原的AUC 为0.830,而作为传统肝损伤标志物的ALT 的AUC 为0.745,表明M30 抗原在慢性乙肝诊断上较ALT 有更高的价值。通过ROC 曲线获得的M30 抗原cutoff值为120U/L,以此值为临界值分析ALT 正常的HBeAg 阴性24例CHB 患者,其中有15例M30 抗原异常,异常率为62.5%,表明M30 抗原较ALT 诊断CHB 价值更高。

综上所述,检测M30 抗原水平能够更好、更直接地反应患者肝脏的损伤情况,采用检测M30 抗原水平的方法来鉴别诊断非活动HBsAg 携带者和慢性乙肝患者,较检测血清ALT 和HBV-DNA 水平的方法具有更好的特异性和灵敏度,具有更高的诊断价值。但是,该方法具有一定的局限性,在丙型肝炎、肝癌和心脏衰竭等其他疾病患者的血清中,M30抗原水平也有一定地升高。因此,需要结合其它检测指标,综合判断评估患者的情况,才能充分发挥其诊断价值。

[1]Najimi M,Smets F,Sokal E.Hepatocyte apoptosis.MethodsMol Biol,2009,481：59

[2] Guicciardi M E,Gores G J.Apoptosis：a mechanism of acute and chronic liver injury.Gut,2005,54：1024

[3]Linder S.Cytokeratin markers come of age.Tumor Biol,2007,28：189

[4]Linder S,Havelka A M,Ueno T,et al.Determining tumor apoptosis and necrosis in patient serum using cytokeratin 18 as a biomarker.Cancer Lett,2004,214：1

[5]中华医学会肝病学分会,感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版).中华肝脏病杂志,2011,19(1)：13

[6]Eren F,Yilmaz Y,Kose S,et al.Caspase-cleaved fragments of cytokeratin 18 in patients with chronic hepatitis B.Clin Chim Acta,2010,411：2029

[7]Perillo R P.Acute flares in chronic hepatitis B：the natural and unnatural history of an immunologically mediated liver disease.Gastroenterology,2001,120：1009