尼古丁对人牙周膜成纤维细胞超微结构及分泌细胞因子的影响*

陈慧中， 卜欠欠， 孔卫东， 曾慧兰， 李 阳， 刘宏伟

牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts，PDLFs)是牙周膜中数量最多、功能最重要的细胞之一，参与胶原蛋白的合成与吸收，与基质形成、骨质形成有关。吸烟是牙周病尤其是重度牙周病的高危因素，尼古丁占烟草生物碱总量约95%以上，近年来尼古丁对牙周组织再生和修复的毒性研究引起关注［1］，而其作用机制尚未十分明确，许多学者从尼古丁对PDLFs的碱性磷酸酶变化、蛋白质合成、尼古丁型乙酰胆碱受体及细胞外基质影响等方面进行研究，证实尼古丁从多方面影响牙周病的发生、发展和预后［2-4］。本研究拟探讨尼古丁对PDLFs的细胞形态、增殖、细胞周期、凋亡及细胞因子生成的影响，以进一步阐明尼古丁致病机制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂与仪器 人牙周膜成纤维细胞株(上海拜力生物科技有限公司);尼古丁(北京伊普瑞斯公司);DMEM/F12培养基和澳洲胎牛血清(fetal bovine serum，FBS;Gibco);青霉素和链霉素(华北制药公司);MTT、胰酶、碘化丙啶(propidium iodide，PI;Sigma);PI-Annexin V双染试剂盒(北京宝赛生物技术公司);CO2培养箱(Thermo Forma);原子力显微镜(Thermo);酶标仪(BioTek);流式细胞检测仪(BD);透射电镜(Philips);转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、细胞间黏附分子 1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)酶联免疫试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和胰岛素样生长因子 I(insulin-like growth factor I，IGF-I)酶联免疫试剂盒(华美生物工程有限公司)。

1.2 细胞培养 PDLFs按(1.0～1.5)×106/L的密度接种于T-25培养瓶，含15%FBS的DMEM/F12进行培养。细胞达80%融合时，0.25%胰蛋白酶消化细胞，1∶2或1∶3比例传代，每3～4 d换液。取3～7代细胞实验。实验组加15%FBS的DMEM/F12培养液配制的不同浓度尼古丁，对照组加含15%FBS的DMEM/F12培养液。

2 方法

2.1 细胞形貌及超微结构观察 (1)细胞爬片后，实验组加0.6 g/L尼古丁孵育24 h，取出盖玻片，2.5%戊二醛固定10 min，漂洗，风干，原子力显微镜观察;(2)PDLFs以6×108/L接种培养，细胞达80%融合，实验组加0.8 g/L 尼古丁，孵育 24 h，2.5%戊二醛固定4 h，1%锇酸固定1～2 h，脱水、包埋、切片，3%醋酸铀－枸橼酸铅双染色，透射电镜观察。

2.2 MTT法测细胞增殖抑制率 细胞以3×107/L接种于96孔板，每孔100 μL，培养24 h。实验组加尼古丁(0.5、0.8、1.0、1.5 g/L)作用 24、48、72 h，每孔加20 μL MTT，孵育4 h，每孔加=甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)150 μL，酶 标 仪 测 吸 光 度(A490)。计算细胞增殖抑制率进行细胞活性评价，细胞生长增殖抑制率(%)=(1－实验组 A490/正常对照组A490)×100%。

2.3 PI法测细胞周期 细胞以2×108/L接种于6孔板培养 24 h，实验组加尼古丁(0.2、0.4、0.6 g/L)孵育24 h，冰乙醇固定，PI染色，流式细胞仪检测，BD FAC Sort Cell Quest软件分析结果。

2.4 Annexin V-FITC/PI双染测细胞凋亡率 实验组加尼古丁(0.5、1.0、1.5 g/L)孵育 24 h，洗涤，离心，加 200 μL 结合缓冲液，分别加 2 μL Annexin VFITC 和2 μL PI，流式细胞仪检测。

2.5 ELISA法检测培养上清细胞因子水平 细胞以2×108/L接种于6孔板培养24 h，实验组加尼古丁(0.4、0.6、1.0 g/L)，24 h 收上清液 －80 ℃冷藏，按ELISA试剂盒步骤操作，酶标仪测吸光度(A450)，CurveExpert 1.3软件计算细胞因子ICAM-1、VCAM-1、VEGF、TGF-β1、IGF-I和 bFGF 浓度。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件，计量资料以均数±标准差(mena±SD)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 尼古丁对PDLFs表面形貌和超微结构的影响

原子力显微镜下见正常细胞呈长梭形，胞质与胞核边界清晰，细胞骨架明显，表面较粗糙，向四周延伸出数量不等的伪足样突起，见图1A。尼古丁作用后，细胞缩小，胞质中见大量空泡，核膜破坏，胞质与胞核边界模糊，见图1B。透射电镜下，正常PDLFs呈圆形或类圆形，细胞膜完整，表面有较多微绒毛和突起，细胞核有单核或多核，形状不规则，核膜清晰，1个或多个核仁，核质比例大，胞浆含散在粗面内质网和核糖体，线粒体嵴清晰连续，见图2A、B、E、G。尼古丁作用后，细胞表面突起和微绒毛增多，胞内大量空泡，水肿明显。胞核固缩崩解，染色质浓缩边集，见图2C、D。粗面内质网扩张成池，内充以低电子密度物质，见图2F。线粒体嵴扩张，见图2H，基质电子密度增高，部分水肿，余细胞器未见明显变化。

Figure 1.Effect of nicotine on surface morphology of PDLFs observed by atomic force microscopy.A1～A3:control group;B1～B3:nicotine(1.0 g/L)group.1:the overall surface morphology;2，3:the enlarged areas.图1 尼古丁对PDLFs表面形貌的影响

Figure 2.Ultrastructure of PDLFs observed by transmission electron microscopy.A，B:overall morphology in control group.C，D:overall morphology in nicotine group;E:mitochondria in control group;F:mitochondria in nicotine group;G:endoplasmic reticulumin in control group;H:endoplasmic reticulum in nicotine group.A，C:×3 700;B，D:×8 900;E，F:×17 500;G，H:×24 000.图2TEM观察PDLFs超微结构

2 尼古丁对PDLFs增殖抑制率的影响

不同浓度尼古丁(0.5、0.8、1.0、1.5 g/L)作用24、48、72 h，均抑制细胞增殖，呈时间和浓度依赖性(P ＜0.05)，见表1、2。

3 尼古丁对PDLFs细胞周期的影响

0.2 、0.4、0.6 g/L 尼古丁作用24 h 后，随浓度增高，各组细胞G0/G1期比例逐渐增高(P＜0.05)，S期和G2期比例则呈下降趋势，见图3、表3。

表1 不同浓度尼古丁对PDLFs增殖的影响Table 1.Effects of different concentrations of nicotine on proliferation of PDLFs(A490.Mean ± SD.n=3)

表2 不同浓度尼古丁作用PDLFs的抑制率Table 2.Inhibitory rate of PDLFs after treatment with nicotine at different concentrations(mean±SD.n=3)

4 尼古丁对PDLFs凋亡率的影响

0.5 、1.0、1.5 g/L尼古丁作用细胞24 h后，细胞凋亡率均高于对照组。对照组早期凋亡比率为(0.700±0.566)%;0.5 g/L组、1.0 g/L组与1.5 g/L组早期凋亡比率分别为(0.750±0.495)%、(0.750±0.495)%和(1.600±0.990)%，虽然高于对照组，但差异无统计学意义(P＞0.05)，见图4。

5 尼古丁对细胞因子分泌水平的影响

不同浓度尼古丁细胞作用后，bFGF水平下降，0.6 g/L尼古丁组与对照组相比有统计学意义(P＜0.05);IGF－I水平下降，呈浓度依赖性(P ＜0.05);ICAM-1水平上升(P ＜0.05)，见表4。VCAM-1水平上升，但差异无统计学意义(P ＞0.05);TGF-β1水平上升，1.0 g/L尼古丁组与对照组相比有统计学意义(P＜0.05)，VEGF水平上升，但差异无统计学意义(P ＞0.05)，见表 5。

讨 论

牙周膜是位于牙骨质和牙槽骨之间的纤维连接组织。PDLFs具多种生物学功能，不仅合成胶原、基质、弹力纤维和糖蛋白，还可分化为成牙骨质细胞、成骨细胞，形成牙骨质、牙槽骨等，尚有吸收胶原吞噬异物的能力，对平衡牙周膜结构和功能，维持、再生和损伤修复牙齿支持组织起重要作用。PDLFs的数量、形态、增殖是其生物学活性如黏附、生物合成和分化等的必要保证。烟草中含4 000多种毒素，如尼古丁、CO、亚硝基胺等，其中主要成分尼古丁对PDLFs的氧化损伤引起关注。吸烟后牙周局部尼古丁浓度增高［5］，使细胞内活性氧自由基陡增，消耗GSH 等抗氧化物质［6］，致细胞凋亡［7］。吸烟者牙周炎区段数高于非吸烟者，且烟量可影响牙周病，即重度吸烟者的牙周炎区段数高于轻、中度吸烟者［8-9］。本研究显示尼古丁抑制细胞增殖，促进其凋亡主要以影响PDLFs膜性结构(线粒体和内质网)破坏为主，导致细胞蛋白合成和有氧呼吸功能受损，影响细胞活性与功能，造成不可逆损伤，从而减弱PDLFs黏附迁移能力，导致牙周病。而细胞内骨架改变可反映外部的刺激作用［9］，至于尼古丁对细胞周期和凋亡率的影响，虽然DNA合成阻滞于G0/G1期，并呈剂量依赖性，但与对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，所以，影响凋亡主要以致膜性结构破坏为主。

Figure 3.Cell cycle distribution of PDLFs treated with nicotine for 24 h.A:control group;B:nicotine(0.2 g/L)group;C:nicotine(0.4 g/L)group;D:nicotine(0.6 g/L)group.图3 尼古丁作用PDLFs 24 h后细胞周期的变化

表3 不同浓度的尼古丁干预PDLFs 24 h后细胞周期的变化Table 3.Cell cycle distribution of PDLFs treated with nicotine at various concentrations for 24 h(%.Mean±SD.n=3)

Figure 4.Apoptotic rate of PDLFs treated with nicotine at various concentrations for 24 h.A:control group;B:nicotine(0.5 g/L)group;C:nicotine(1 g/L)group;D:nicotine(1.5 g/L)group.图4 不同浓度尼古丁作用PDLFs 24 h后的凋亡率

表4 尼古丁对PDLFs分泌bFGF、IGF-I和ICAM-1的影响Table 4.Effects of nicotine on secretion of bFGF，IGF-I and ICAM-1 in PDLFs(mean±SD.n=3)

表5 不同浓度尼古丁对PDLFs分泌VCAM-1、TGF-β1和VEGF的影响Table 5.Effects of nicotine on secretion of VCAM-1，TGF-β1and VEGF in PDLFs(ng/L.Mean±SD.n=3)

尼古丁尚可在细胞水平干扰损害免疫细胞功能，影响牙周病进程。bFGF可促进牙周细胞增殖，促进牙周创伤愈合早期血管网的形成［10］。其分泌水平下降，牙周组织修复受到抑制。杜克难等［11］报道bFGF可诱导胚胎早期中胚层的生长，有促进口腔唇部软组织创伤愈合的作用。IGF-I有多种生物学活性，包括促进细胞生长、分化及创口愈合等，有强烈的促进PDLFs分裂、增殖作用［12］，其机制可能通过牙周膜表面的IGF型受体发挥作用［13］。本实验表明，尼古丁使PDLFs分泌bFGF和IGF-I水平均下降，抑制了PDLFs分裂和增殖。

ICAM-1是免疫球蛋白超家族成员，调节炎症信号转导，在与白细胞结合和向炎症区域转移中具重要作用［14］。周卫辉等［15］报道尼古丁可增加内皮细胞ICAM-1表达，促进中性粒细胞与内皮细胞黏附，在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)慢性炎症发病中起重要作用。VCAM-1激活血管内皮细胞表达血管黏附分子，与单核细胞和淋巴细胞结合，从血管内壁移行至炎症部位，促发炎症。本实验结果显示尼古丁使PDLFs分泌ICAM-1和VCAM-1水平上升，提示尼古丁可能促进牙周炎症发生。

TGF-β1能调节牙周组织的免疫应答，促进牙周膜细胞增殖，增加成纤维细胞合成胶原及纤维黏连素，减少基质金属蛋白酶和纤溶酶激活剂的合成和结缔组织的破坏，使牙周软、硬组织修复再生［16］。炎症刺激可使VEGF分泌增加，促进局部血流和自身分泌，促血管增殖。但吸烟者的牙周处于缺氧状态，VEGF的高表达虽可促进血管生成，但正调节的VEGF mRNA及其蛋白又可募集破骨细胞，加速牙槽骨吸收［17］。本实验显示TGF-β1和VEGF浓度上升，有利于牙周组织修复。VEGF变化的意义尚需进一步研究。

综上所述，尼古丁改变PDLFs细胞形态及超微结构，抑制细胞增殖，促进凋亡，影响其黏附功能;使PDLFs分泌bFGF和IGF-I水平下降，抑制PDLFs增殖;使ICAM-1和VCAM-1分泌增加，破坏牙周组织;而TGF-β1和VEGF等在炎症刺激后分泌增加则有助于修复牙周组织。研究显示VEGF存在双重作用，在不同环境中表达水平有差异，其表达变化的意义尚待探讨。

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