L-4F改善狼疮样小鼠肾脏病变*

吴 帆， 张 普， 俞佳文， 卢婷婷， 李校堃， 林灼锋△

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是由自身免疫引起多个系统和脏器受累的自身免疫性疾病，由于体内的细胞和体液免疫功能障碍，导致产生了多种的自身抗体，然而其具体的发病机制还不明确［1］。载脂蛋白 A-I(apolipoprotein A-I，apoA-I)是高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)的一种主要成分，在HDL的抗炎效应中起到了重要的作用，在动物模型中介导了缓解系统性红斑狼疮的保护作用［2-3］。从 apoA-I类似肽4F，根据apoA-I的生物特性，设计出的具有双亲性的apoA-I模拟肽L-4F，由18个L-氨基酸组成，具有通过哺乳动物胃肠道抑制酶降解的优点，并能增强HDL的抗炎能力［4］。早期的研究发现，口服L-4F能促使HDL从促炎因子转化为抗炎因子，促进胆固醇流出，并使其从巨噬细胞中逆向转运，同时减少apoE－/－小鼠中主动脉的损伤但不影响其血清胆固醇的水平［5］。ApoE－/－Fas－/－C57BL/6 小鼠在正常饮食情况下会自发地形成IgG自身抗体、肾小球肾炎、骨质疏松和粥样硬化等系统性红斑狼疮病变［6-7］。我们早期的研究发现，L-4F 能缓解 apoE－/－Fas－/－C57BL/6 小鼠的狼疮病变状况［8］。本文将继续探讨L-4F对系统性红斑狼疮小鼠肾脏病变的影响，从而进一步揭示L-4F对红斑狼疮性肾脏病变的治疗意义。

材料和方法

1 动物

ApoE－/－Fas－/－C57BL/6 小鼠为 apoE－/－和Fas－/－单基因敲除小鼠相互杂交繁殖后筛选的双基因缺陷小鼠，上述单基因敲除小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并在温州医学院SPF级环境下繁殖饲养。

2 方法

2.1 动物处理 8～9周龄时，雌性 apoE－/－Fas－/－小鼠随机地分为2组:L-4F治疗组(15 mg/kg，0.1 g/L Tween-20溶解在pH 7.0的50 mmol/L碳酸氢铵缓冲液中，腹腔注射给药，n=10)和空白对照组(生理盐水腹腔注射，n=10)。在L-4F处理过程中，分别在0、5、10、15、20、25 周收集血样标本，观察抗双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)IgG和总IgG的变化状况。L-4F处理25周后，小鼠饥饿过夜，通过心脏穿刺的方法收集血样后处死，然后采用冰冷PBS灌注心脏，收集脾脏，淋巴结和肾脏等相关器官组织，按下列方法进行相应的实验。

2.2 自身抗体和细胞因子测定分析 将上述收集的血清样品，采用ELISA技术检测总IgG抗体、白细胞介素 6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、抗 dsDNA、抗氧化磷脂(POVPC和PGPC)等血清抗体水平 (Bethyl Laboratories);采用ELISA技术检测血清总脂联素滴度;同时采用生化检测法检测血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的含量。

2.3 肾脏组织学分析 小鼠处死后，取出其中一个肾脏用10%甲醛固定，石蜡包埋组织，切片至5 μm，使用HE染色法对肾脏进行染色。通过计算机辅助图像软件(Image-Pro Plus)对肾小球大小面积进行分析。即在相同具有代表性的区域内观察每个样品中25到30个单位的肾小球，并以此计算每只小鼠的平均肾小球丛。

2.4 蛋白尿测定 在给予L-4F治疗25周时，收集每只小鼠的晨尿，并采用蛋白尿检查试纸(Bayer)测定新鲜尿液的蛋白水平。蛋白尿表示为下列的水平:0=无，1=微量，2= ～30 mg/dL，3= ～100 mg/dL，4= ～300 mg/dL，5≥2 000 mg/dL。

3 统计学处理

采用Prism 3.0(GraphPad)对数据进行分析，两组之间的均数比较采用t检验。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 L-4F对狼疮样自身免疫病变表型特征的影响

给药27周后，与对照组小鼠相比，L-4F的治疗能使 apoE－/－Fas－/－C57BL/6 小鼠的淋巴结显著减小(图1A)，脾脏重量显著降低(图1B)。这些结果说明，L-4F对自身免疫性疾病狼疮样病变表型具有抑制作用。

Figure 1.The changes of weight of lymph nodes(A)and spleen(B)in apoE－/－ Fas－/－ C57BL/6 mice after L-4F treatment.Mean ± SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs control.图1 L-4F处理后淋巴结及脾脏大小的变化

2 L-4F对抗dsDNA及抗氧化磷脂抗体及炎症因子水平的影响

dsDNA抗体的出现是lupus发病过程中最为重要的临床检测标志物之一。我们的结果显示，L-4F治疗27周后，与对照组相比较，给药组的血清抗ds-DNA IgG抗体明显低于对照组(图2A)，但其总IgG水平没有显著差异(图2B)。

L-4F治疗后，与空白对照组相比，血清抗氧化磷脂PGPC和POVPC的IgG自身抗体水平显著下降，见图3A、B。此外，炎症因子IL-6和TNF-α循环水平均显著下调(P ＜0.05)，见图3C、D。

Figure 2.The changes of anti-dsDNA IgG(A)and total IgG(B)levels in apoE－/－Fas－/－C57BL/6 mice after L-4F treatment.Mean ± SD.n=10.*P ＜0.05 vs control.图2 L-4F处理后抗dsDNA IgG和总IgG水平的变化

Figure 3.The changes of serum oxidative phospholipid antibodies(A，B)and inflammatory factors(C，D)in apoE－/－Fas－/－C57BL/6 mice after L-4F treatment.Mean ± SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.图3 L-4F治疗后血清氧化磷脂抗体及炎症因子水平的变化

3 L-4F对狼疮肾病变状况的影响

肾脏疾病通常随着尿蛋白水平的增加而加重，在给药后的25周时间里，L-4F组与对照组相比尿蛋白水平更低，且BUN水平均有所下降，见图4A、B。组织学研究显示，L-4F治疗组小鼠平均肾小球面积显著低于空白对照组，见图4C。

4 L-4F对血清脂联素水平表达的影响

与对照组相比，L-4F能显著上调血清脂联素水平(P ＜0.05)，见图5。

讨 论

SLE是自身免疫介导的、以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病，血清中出现以抗核抗体为代表的多种自身抗体和多系统累及是SLE的两个主要临床特征［9］。早在1976年，人们已经注意到了系统性红斑狼疮死亡率曲线呈“双峰”模式，一个是在活动性狼疮早期阶段败血症的高发生率，另一个是非活动性狼疮晚期阶段心肌梗死的高发生率［10］。

Figure 4.The effect of L-4F treatment on lupus nephritis.A:urine protein level;B:blood urea nitrogen(BUN)level;C:glomerular tuft size(HE staining，×400).Mean± SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control图4 L-4F对狼疮肾病变状况的影响

Figure 5.L-4F stimulated adiponectin expression in apoE－/－Fas－/－ C57BL/6 mice.Mean ± SD.n=10.＊＊ P ＜0.01 vs control.图5 L-4F 上调 apoE－/－Fas－/－小鼠脂联素的表达

ApoA-I是HDL的一种主要成分，其主要功能是通过ABCA1途径转运清除磷脂和胆固醇，L-4F是一种apoA-I模拟肽，在apoE-null小鼠的饮用水中加入L-4F能够显著降低动脉粥样硬化病变，动脉粥样硬化的损伤减少达到75%以上，但对血浆脂类水平没有显著的影响［11］，除了参与调控胆固醇之外，apoA-I模拟肽还具有良好的抗炎效应，可抑制大鼠中的炎症反应，提高存活率［12］。

我们的前期实验表明，在 apoE－/－Fas－/－C57BL/6双基因敲除自发性引起的鼠类狼疮模型中，L-4F治疗后将有效地减轻狼疮样自身抗体产物、肾小球肾炎、骨质减少的表型［8］。在本实验中，我们进一步发现，与空白对照组相比，L-4F除了能降低肾小球丛大小、抗PGPC和POVPC抗体水平之外，还能显著降低血清促炎细胞因子IL-6和TNF-α的水平。这些结果充分说明，L-4F能显著缓解apoE－/－Fas－/－C57BL/6小鼠的狼疮病变状况。

肾脏受累和肾小球肾炎是SLE患者中常见且较为严重的并发症之一，同时肾脏损伤的严重性与疾病表型的程度有关。在本实验中 apoE－/－Fas－/－C57BL/6小鼠给药25周后，与对照组小鼠相比较，L-4F治疗组小鼠的尿蛋白和血清尿素氮水平显著降低;此外，在组织形态学方面，L-4F治疗组小鼠平均肾小球面积显著低于空白对照组小鼠。这些结果表明，L-4F治疗后，肾小球的病变得到一定程度的缓解。

脂联素是一种来源于脂肪细胞分泌表达的荷尔蒙因子。早期的研究发现，脂联素对包括糖尿病、心血管、肥胖等多种代谢引发的疾病发病具有显著的抑制作用［13-15］。此外，我们的前期临床研究发现，在慢性肾病发病过程中，脂联素水平随肾功能的丢失而显著上升［16］。在本实验中，L-4F治疗能显著降低apoE－/－Fas－/－C57BL/6 小鼠尿蛋白和 BUN 的水平，并减少肾小球的面积。这些结果说明L-4F能改善狼疮肾脏病变的恶化状况;与此同时，L-4F治疗显著上调血清脂联素的水平。因此，我们推断，肾病发病过程中脂联素水平的上升是机体自身的一种保护作用;L-4F上调脂联素水平是一种积极的生物学效应。

综上所述，L-4F能显著改善狼疮样小鼠的肾脏病变状况，对治疗狼疮肾病变具有一定的临床应用价值和意义，但其具体的作用机制有待于进一步研究。

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