激活FXR抑制MRL/lpr狼疮小鼠肝损害的研究*

连 帆， 王 于， 李家平， 杨建勇， 范文哲， 张应强， 许韩师， 梁柳琴， 杨岫岩

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是多系统损害的系统性自身免疫病，肝脏是常见的受累器官之一。据报道，SLE肝脏损害的发生率约为6% ～30%［1-2］。SLE引起的肝损害主要表现为肝肿大、黄疸、肝功能异常等，可以出现脂肪肝、门脉炎症细胞浸润、慢性活动性肝炎、肝硬化、胆汁淤积、肝细胞坏死等病理征象［3］。法尼酯衍生物X受体(farnesoid X receptor，FXR)是一种主要在肝肠系统等组织器官表达的胆汁酸受体，属于激素核受体超家族的一员，在胆汁酸代谢及胆固醇代谢中发挥重要作用［4］。近年来有研究指出，FXR具有抗炎和调节免疫的作用，FXR在自身免疫性疾病中有其独特的作用［5-6］。前期研究表明，FXR受体激动剂在动物模型中可减轻肝脏炎症损伤［7］。本研究旨在观察FXR在SLE肝损害中的作用，探讨FXR激活改善SLE肝损害的部分可能机制。

材料和方法

1 实验设计和动物模型建立

雌性MRL/lpr小鼠和BALB/c小鼠(18周龄)购自上海斯莱克公司。饲养环境温度25℃恒温，自由摄水，12 h交替照明。以伴刀豆球蛋白 A(concanavalin A，ConA;购自Sigma)诱导肝损害。尾静脉一次性注射 ConA 20 mg/kg。对照组注射0.5 mL 0.9%生理盐水。

MRL/lpr小鼠FXR的激活:在ConA注射前14 d开始，以含有1% 鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid，CDCA;FXR 激动剂)［8］的饲料连续喂饲实验动物。对照组MRL/lpr小鼠和 BALB/c小鼠在注射ConA前喂饲普通饲料。另空白对照组小鼠不喂饲CDCA，并在尾静脉中注射生理盐水。

2 观察指标

2.1 测定指标 在注射 ConA 后0、4、8、12、16和24 h取血，离心收集血浆，检测肝功能损伤指标丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST);检测炎症细胞因子干扰素 γ(interferon γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)。转氨酶活性在全自动生化仪(Hitachi)上检测。细胞因子检测按照Bio-Plex Suspension Array系统标准流程操作。

2.2 qRT-PCR检测 FXR mRNA表达 采用 qRTPCR技术，以 β-actin作为内参照，利用 Trizol-氯仿-异丙醇法提取总RNA，逆转录合成cDNA，加入上游引物、下游引物和SYBR预混液等共20 μL(Applied Biosystems)，反应体系在ABI PRISM 7700 PCR仪进行扩增。FXR上游引物5’-CCCTGCTTGATGTGCTACAA-3’，下游引物 5’-GTGTCCATCACTGCACATCC-3’;β-actin 上游引物 5’-CAGCTGAGAGGGAAATCGTG-3’，下游引物 5’-CGTGCCAATAGTGATGACC-3’。所得结果以 FXR/β-actin的积分吸光度比值表示。

2.3 Western blotting检测FXR蛋白表达 取-80℃保存的肝脏组织，在冰面上提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，制备上样蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后5%脱脂奶粉封闭1 h，0.3%TBST洗膜3次，加入I抗 FXR 抗体(Santa Cruz)，4 ℃孵育过夜，0.1%TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的II抗(Santa Cruz)，室温孵育1 h，洗膜，ECL化学发光法曝光。以β-actin作为内参照。

2.4 肝脏组织病理学检查 取小鼠肝脏后，4%多聚甲醛固定24 h，逐级脱水，常规石蜡包埋，切片，HE染色。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，统计学分析采用SPSS 13.0统计软件，两组均数比较采用Student's t检验;多组间均数比较用One-way ANOVA，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 FXR在MRL/lpr狼疮小鼠肝脏中低表达

取MRL/lpr狼疮小鼠与BALB/c小鼠肝脏组织，应用qRT-PCR和Western blotting测定FXR的表达。结果显示FXR mRNA及蛋白表达较BALB/c小鼠明显降低，见图1。

2 激活FXR减轻ConA诱导的自身免疫性肝炎炎症损伤

ConA诱导的肝脏损伤在病理上表现为肝细胞坏死、单个核细胞浸润、肝窦出血等。在激活FXR的MRL/lpr小鼠，ConA诱导的肝脏炎症表现明显减轻，见图2。

Figure 2.FXR activation attenuated ConA-induced hepatitis(HE staining，×100).A:normal liver;B:ConA-induced hepatitis in BALB/c mice;C:ConA-induced hepatitis in MRL/lpr mice;D:ConA-induced hepatitis in MRL/lpr mice after FXR activation by CDCA.图2 激活FXR减轻ConA诱导的肝损害

ConA诱导的小鼠肝损害还表现为转氨酶活性的升高，峰值出现在注射ConA后12 h左右，随后逐渐下降。在未受刺激时，BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠的转氨酶水平相近，但在用ConA诱导肝损害后，MRL/lpr小鼠的转氨酶活性明显高于BALB/c小鼠。CDCA激活FXR的小鼠转氨酶活性明显低于MRL/lpr+ConA组，见图3。

3 激活FXR减少炎症因子的表达

BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠在注射ConA后，血清 TNF-α、IFN-γ和 IL-6的水平均明显升高，以MRL/lpr小鼠的炎症因子水平升高为著;而CDCA预处理的小鼠炎症因子水平明显降低，见图4。

讨 论

SLE是累及多器官、多系统的自身免疫性疾病［9-10］，肝脏是最常受累的器官之一，有报道，狼疮肝损害在临床上常被低估［3，11］。狼疮肝损害的机制目前仍未明确，本研究探讨FXR在狼疮肝损害的作用，提示其激活可能减轻狼疮肝损害，为狼疮肝损害的治疗提供了一个可能途径。

Figure 3.FXR activation protected against liver injury in MRL/lpr mice.Mean±SD.n=10.*P ＜0.05 vs MRL/lpr+ConA.图3 FXR激活对MRL/lpr小鼠肝脏的保护作用

Figure 4.FXR activation suppressed production of inflammatory cytokines in MRL/lpr mice.Mean ± SD.n=10.*P ＜0.05 vs MRL/lpr+ConA;△P＜0.05 vs BALB/c+ConA.图4 FXR激活减少肝损害MRL/lpr小鼠炎症因子释放

FXR最初是作为胆汁酸运送的受体而被认识的，它已被证实参与了炎症因子的表达［12-13］。FXR对肝脏自然杀伤T细胞的调节起作用［6］，在小肠和大肠炎症中，FXR 激活减少 IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌［14］。而本研究提供的证据表明FXR在狼疮小鼠肝损害中起保护作用，FXR的激活能减轻肝损害。

MRL/lpr小鼠是高度模拟SLE的转基因小鼠，在未受刺激时，MRL/lpr小鼠并未出现肝酶升高，这与前人的研究相吻合［14］。但我们的研究表明，FXR在MRL/lpr小鼠低表达，即使这些小鼠并未出现明显肝损害的临床征象。研究提示，FXR在狼疮肝损害的病理生理机制中可能是一个负性调节因子，这一作用甚至存在于肝损害出现症状以前。

由于MRL/lpr小鼠和对照的正常BALB/c小鼠肝酶学在未受刺激时并无明显差别。ConA诱导的肝脏炎症是T细胞激活的结果，与SLE肝脏损害有许多相似之处，且伴有一系列炎症因子的升高。在我们的研究中，MRL/lpr小鼠对ConA更为敏感，更易出现肝损害，这一点可部分解释某些前人的研究，即MRL/lpr小鼠具有肝脏损害的趋向性，在较大周龄时容易出现自身免疫性胆管炎［15］。

CDCA激活FXR的MRL/lpr小鼠在ConA诱导的肝脏炎症较 MRL/lpr+ConA组明显减轻。TNF-α、IFN-γ和IL-6在狼疮肝损害和ConA诱导的肝炎均有重要意义［16-18］。保护性因子IL-6和损伤性因子TNF-α、IFN-γ之间的平衡对肝损害的发生发展有重要作用。我们的研究显示，在注射ConA后，MRL/lpr小鼠炎症因子的水平较对照BALB/c更高，显示其在未受刺激时可能存在某些未显示出临床症状的隐性病理状态，因而对肝损害因子更敏感。激活FXR对MRL/lpr小鼠具有保护作用，其病理及炎症因子表达均较FXR未激活组有明显改善。这可能是因为FXR在CD4、CD8、CD19和CD14阳性的免疫细胞上表达，而CDCA激活FXR后减轻了T细胞介导的肝炎［19］。

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