乙型肝炎病毒X蛋白抑制SFRP5启动子的活性*

陈林林， 谢 青，单晓亮， 权会琴，陈庆美， 周 帆，聂 丹， 唐 霓

全世界大约有4亿人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，中国约占 1/3［1］。乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科，全长3.2 kb，含有4个部分双链的开放读码框，分别编码核心蛋白、表面抗原、X蛋白以及病毒DNA聚合酶，其中乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)的生物学功能较活跃，已明确和肿瘤的发生相关。

分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)家族作为肿瘤抑制蛋白，是Wnt/βcatenin信号转导通路的拮抗蛋白。分泌型卷曲相关蛋白5(secreted frizzled-related proteins 5，SFRP5)是SFRPs家族(SFRP1～5)成员之一，其表达下调可减弱对Wnt信号通路的抑制作用，促使通路活化，异常激活的Wnt信号转导通路可参与人类多种肿瘤的发生［2-3］。有研究发现，HBx可通过激活 Wnt/β-catenin信号通路，导致细胞异常增殖，从而参与原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinogenesis，HCC)的发生，但具体机制不明。本研究拟在细胞水平研究HBx能否影响SFRP5启动子活性，并且深入分析HBx下调SFRP5基因启动子的分子机制。

材料和方法

1 主要质粒和细胞

人肝癌细胞系 Huh 7、人正常肝细胞系LO2、萤光素酶报告质粒pGL3-Basic、对照质粒载体pRL-TK和大肠杆菌DH10B均为本实验室保存。

2 主要试剂

Lipofectamine 2000购自Invitrogen;限制性核酸内切酶Nhe I和BglⅡ、T4 DNA连接酶、Wizard质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒和基因组DNA提取试剂盒均为Promega产品;1%青/链霉素和MEM液体培养基购自HyClone;胎牛血清购自Gibco;其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物序列见表1，由Invitrogen合成。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3 主要方法

3.1 SFRP5截短体启动子报告载体的构建及鉴定根据SFRP5启动子序列设计5对截短体引物，扩增长度分别为525 bp、858 bp、1 282 bp和1 724 bp和2 119 bp。首先提取Huh 7细胞基因组DNA作为模板，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增SFRP5启动子截短体。PCR反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性1 min，最适退火温度退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃后延伸10 min，退火温度及循环数见表1。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙啶染色后，用凝胶成像仪记录。胶回收PCR产物与pGL3-Basic载体同时用 Nhe I和BglⅡ双酶切，T4 DNA连接酶16℃过夜连接，产物转化DH10B感受态菌。挑选阳性克隆，扩增后小量提取质粒进行酶切鉴定并测序。

3.2 细胞转染及病毒感染 按4×105cells/well将LO2细胞铺于60 mm培养皿中，待细胞长至50%融合时进行转染。共转染质粒2.25 μg，其中 pRL-TK质粒用量均为 0.25 μg，质粒分为 6 组，用量各 2 μg，分别命名为:pGL3-P1(－478 bp～+47 bp)，pGL3-P2(－811 bp～ +47 bp)，pGL3-P3(－1 235 bp～ +47 bp)，pGL3-P4(－1 677 bp～ +47 bp)，pGL3-P5(－2 072 bp～ +47 bp)，pGL3-Basic。次日将细胞重新铺板，细胞贴壁后每组细胞按105个细胞铺于24孔板中，分别感染最适滴度的感染编码HBx的腺病毒(Ad-HBx)或编码绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)。每组设3个复孔，病毒感染后36 h收集细胞进行萤光素酶活性检测。

3.3 SFRP5启动子活性检测 按照Promega公司双萤光素酶检测试剂盒说明书进行操作，主要步骤为:PBS清洗细胞后加入 100 μL 1×passive lysis buffer，把裂解产物转移到1.5 mL Eppendorf管中，室温14 000 r/min离心10 min，收集上清液。TK质粒作为内参对照标化转染效率，每组的相对萤光素酶活性用萤火虫萤光素酶活性与海肾萤光素酶活性的比值来表示。

4 统计学处理

每次实验设3个复孔，进行独立的3次重复实验。用SPSS 15.0统计软件进行分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，各组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SFRP5启动子截短突变体报告载体的构建

如图1所示，PCR扩增的SFRP5启动子截短体长度分别为 525 bp、858 bp、1 282 bp、1 724 bp 和2 119 bp。用Nhe I和BglⅡ限制性内切酶对pGL3-P1～P5重组质粒分别进行双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳，可见大小约 525 bp、858 bp、1 282 bp、1 724 bp和2 119 bp的条带，符合预期结果，见图2。DNA测序结果与PubMed所提供的人类SFRP5基因启动子序列完全一致，证明质粒构建成功。

Figure 1.PCR products of SFRP5 promoter.1:PCR product of 525 bp(－478 bp～ +47 bp);2:PCR product of 858 bp(－811 bp～ +47 bp);3:PCR product of 1 724 bp(－1 677 bp～ +47 bp);4:PCR product of 2 119 bp(－2 072 bp～ +47 bp);5:PCR product of 1 282 bp(－1 235 bp～ +47 bp);M:DNA marker 2000图1 SFRP5启动子截短体的PCR扩增

2 重组腺病毒病毒感染

采用Ad-HBx或Ad-GFP腺病毒来观察和评估感染效率。感染后24 h倒置荧光显微镜可观察到部分绿色荧光，HBx感染组和GFP对照组感染率没有明显差异，见图3。

Figure 2.Identification of SFRP5 promoter recombinant plasmids by restriction enzyme digestion.1，3，5，7，9:pGL3-P1～pGL3-P5;2，4，6，8，10:pGL3-P1 ～ pGL3-P5 digested by Nhe I and BglⅡ;M:DNA marker 2000.图2 SFRP5启动子区截短报告质粒的酶切鉴定

3 HBx下调SFRP5启动子活性

将pGL3-P1～5或阴性对照质粒pGL3-Basic与pRL-TK共转染LO2细胞，转染后24 h分别感染Ad-GFP或Ad-HBx，同时以pGL3-Basic和pRL-TK共转染组为对照组。pGL3-P1～5和pRL-TK共转染LO2细胞，相对萤光素酶活性与对照组相比明显升高，萤光素酶活性分别为(6.32±0.04)倍(－478 bp～+47 bp)、(5.79 ±0.32)倍 (－811 bp～ +47 bp)、(3.59±0.34)倍(－1 235 bp～ +47 bp)、(3.86±0.39)倍(－1 677 bp～ +47 bp)和(3.26±0.42)倍(－2 072 bp～+47 bp)(均P＜0.05)。过表达HBx后萤光素酶活性分别为(3.55±0.37)倍(－478 bp～+47 bp)(P＜0.05)、(3.15±0.25)倍 (－811 bp～+47 bp)(P＜0.05)、(2.59±0.34)倍(－1 235 bp～ +47 bp)、(2.96± 0.50)倍(－1 677 bp～ +47 bp)和(1.97±0.15)倍(－2 072 bp～ +47 bp)。分析后可观察到HBx明显抑制SFRP5启动子活性，抑制率分别为44%(－478 bp～+47 bp)(P＜0.05)、46%(－811 bp～ +47 bp)(P＜0.05)、28%(－1 235 bp～ +47 bp)、24%(－1 677 bp～ +47 bp)和40%(－2 072 bp～ +47 bp)，见图4和表2。

Figure 3.Fluorescence images of LO2 cells 24 h after Ad-GFP(A)and Ad-HBx(B)infection(×200).图3 荧光显微镜观察腺病毒感染效率

Figure 4.Analysis of lusiferase activity of LO2 cells which were transfected with constructed plasmids and infected by Ad-GFP and Ad-HBx.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs pGL3-Basic;#P ＜0.05 vs GFP.图4 SFRP5启动子截短体萤光素酶检测

表2 萤光素酶活性分析Table 2.Analysis of luciferase activity(mean±SD.n=3)

讨 论

已有报道HBV感染相关的肝癌组织中发现Wnt/β-catenin 信号通路的异常活化［4-7］。Wnt/βcatenin信号通路异常活化的原因可能包括如β-连环蛋白(β-catenin)、结肠腺瘤性息肉病相关因子(adenomatous polyposis coli，APC)等的突变和一些拮抗因子的异常失活。Wnt/β-catenin信号通路拮抗因子主要包括Dickkopf因子和SFRPs家族。SFRPs家族含有5个分泌型的糖蛋白家族成员(SFRP1～5)，SFRPs基因定位于染色体8p12～11.1，其蛋白约有300个氨基酸残基，包括一个同源的N2末端和一个C2末端。SFRPs的分子结构与Wnt受体极为相似，均具有相同的半胱氨酸富集结构域，它们可通过竞争性结合fozivudine tidoxil(Fzd)受体而抑制Wnt信号通路的活化。

本研究发现，转染不同区段的SFRP5启动子截短体后，－478 bp～+47 bp区域启动子活性最高，与对照相比，提高了6.32倍，用Ad-HBx感染后启动子活性明显下降。这提示这个区域可能存在调控SFRP5启动子转录活性的关键元件，采用生物信息学分析结果显示此区域包括激活蛋白2(activator protein 2，AP-2)、GC 盒(GC box/C/EBP)等重要调节元件，对于SFRP5启动子的调控功能非常重要。但是HBx具体通过哪种机制下调SFRP5启动子活性，调节机制尚不明确。

DNA甲基化和组蛋白去乙酰化可以使SFRPs启动子活性下降，可能导致肝癌的发生。DNA甲基化是最早发现的表观修饰途径之一，能抑制功能基因的表达［8］。研究发现除了甲基化修饰的DNA可直接作用于甲基化敏感转录因子，失去与DNA结合的能力从而阻断转录，此外甲基化黏附分子可通过作用于甲基化非敏感转录因子，从而阻断转录［9-12］。除了基因启动子区直接甲基化修饰调控基因转录外，组蛋白修饰在基因表达调控中也起到至关重要的作用。在组蛋白H3上，共有5个赖氨酸位点可以被甲基化修饰，一般来说，组蛋白H3的4号赖氨酸(histone 3 lysine 4，H3K4)的甲基化主要聚集在活跃转录的启动子区域。组蛋白H3的9号赖氨酸(histone 3 lysine 9，H3K9)的甲基化同基因的转录抑制及异染色质有关。EZH2(enhancer of zeste homolog 2)可以甲基化组蛋白H3的27号赖氨酸(histone 3 lysine 27，H3K27)，导致相关基因的沉默，并且与X染色体失活相关。组蛋白H3的36号赖氨酸(histone 3 lysine 36，H3K36)的甲基化与基因转录激活相关［13-14］。

综上所述，本研究成功构建了SFRP5启动子区5个截短突变报告质粒，通过对各个截短体转录活性的调控寻找核心启动子区域，为寻找影响启动子活性的关键转录因子提供依据;并且检测了各区段启动子转录活性，发现HBx可以明显下调SFRP5启动子区活性，提示HBx引起的SFRP5启动子区活性下降，可能参与Wnt信号的异常活化，并与HBV感染相关肝癌的发生密切相关。

［1］ Jiang S，Yang Z，Li W，et al.Re-evaluation of the carcinogenic significance of hepatitis B virus integration in hepatocarcinogenesis［J］.PLoS One，2012，7(9):e40363.

［2］ 李海英，张 力，潘欢乐，等.Wnt信号通路在食管癌细胞放射抗拒性形成中的作用［J］.中国病理生理杂志，20l2，28(9):1623-1626.

［3］ Gatcliffe TA，Monk BJ，Planutis K，et al.Wnt signaling in ovarian tumorigenesis［J］.Int J Gynecol Cancer，2008，18(5):954-962.

［4］ Kim SM，Choi EJ，Song KJ，et al.Axin localizes to mitotic spindles and centrosomes in mitotic cells［J］.Exp Cell Res，2009，315(6):943-954.

［5］ Fumoto K，Kadono M，Izumi N，et al.Axin localizes to the centrosome and is involved in microtubule nucleation［J］.EMBO Rep，2009，10(6):606-613.

［6］ Alexandrova EM，Sokol SY.Xenopus axin-related protein:a link between its centrosomal localization and function in the Wnt/β-catenin pathway［J］.Dev Dyn，2010，239(1):261-270.

［7］ Zhang X，Dong N，Zhang H，et al.Effects of hepatitis B virus X protein on human telomerase reverse transcriptase expression and activity in hepatoma cells［J］.J Lab Clin Med，2005，145(2):98-104.

［8］ Esteller M.Epigenetics in cancer［J］.N Engl J Med，2008，358(11):1148-1159.

［9］ Cho YH，Yazici H，Wu HC，et al.Aberrant promoter hypermethylation and genomic hypomethylation in tumor，adjacent normal tissues and blood from breast cancer patients［J］.Anticancer Res，2010，30(7):2489-2496.

［10］ van Roon EH，van Puijenbroek M，Middeldorp A，et al.Early onset MSI-H colon cancer with MLH1 promoter methylation，is there a genetic predisposition［J］.BMC Cancer，2010，10:180.

［11］ Kile ML，Baccarelli A，Tarantini L，et al.Correlation of global and gene-specific DNA methylation in maternal-infant pairs［J］.PLoS One，2010，5(10):e13730.

［12］ Ogino S，Chan AT，Fuchs CS，et al.Molecular pathological epidemiology of colorectal neoplasia:an emerging transdisciplinary and interdisciplinary field［J］.Gut，2011，60(3):397-411.

［13］ Del Rizzo PA，Couture JF，Dirk LM，et al.SET7/9 catalytic mutants reveal the role of active site water molecules in lysine multiple methylation［J］.J Biol Chem，2010，285(41):31849-31858.

［14］ 赵成海，卜献民，张 宁，等.Wnt拮抗因子SFRP2在胃癌中的甲基化和异常表达［J］.中国病理生理杂志，2009，25(8):1617-1620.