辛伐他汀通过抑制p38 MAPK活化降低肝硬化门静脉高压大鼠门静脉压力*

陈埏芳， 钟 健， 汤绍辉， 陈昭琳， 吴小娟， 胡建军， 劳学军

门静脉高压症(portal hypertension，PHT)是肝硬化失代偿期的主要临床表现之一，包括侧支循环的建立和开放、腹水和脾大。食道静脉曲张、破裂出血是肝硬化患者死亡的重要原因之一，其主要预防措施是降低门静脉压力(portal pressure，PP)［1］。目前临床上常用的降低门静脉压力、预防食道静脉丛出血的药物是普萘洛尔，但只有不到50%患者获得较满意的疗效;加之应用普萘洛尔后，肝脏血液灌注减少，可能使肝功能损害加重，故限制了其临床应用［2］。因此，探索新的降低门静脉压力的药物已成为当前的研究热点。

近年来，一些动物实验［3-4］和临床研究［2，5］显示，他汀类药物可改善硬化肝脏的窦内皮功能障碍，降低肝内血管阻力，进而降低门静脉压力，改善肝脏灌注。其机制与改变RhoA/Rho激酶和PI3K/Akt信号通路活性，增加肝脏内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表达水平和提高其活性，使一氧化氮(nitric oxide，NO)释放增加相关。既往有研究显示，辛伐他汀可以抑制p38 MAPK信号通路，提高脐静脉内皮细胞eNOS的表达水平［6］。提示辛伐他汀增加肝硬化肝脏组织NO释放可能是通过改变p38 MAPK信号通路活性，目前国内外尚未见相关研究报道。鉴于此，本研究拟构建大鼠肝硬化门静脉高压症模型，探讨辛伐他汀降低肝硬化门静脉压力的机制是否有p38 MAPK信号通路的参与，为其临床应用提供更充实的实验依据。

材料和方法

1 材料

辛伐他汀(舒降之)购于杭州默沙东制药有限公司，四氯化碳(分析纯)购于天津化学试剂公司，抗p38 MAPK、抗磷酸化p38 MAPK、抗eNOS和抗磷酸化eNOS抗体购于Cell Signaling Technology，抗β-actin抗体购于 Abcam，p38 MAPK特异性抑制剂SB203580购于Calbiochem。

2 方法

2.1 肝硬化门静脉高压症大鼠模型的制备 雄性SD大鼠57只，正常饲养至体重达250～280 g，随机取11只大鼠作为正常对照，普通饮食;余46只采用四氯化碳复合因素改良法［7］制作大鼠肝硬化PHT模型。即前2周喂养含79.5%玉米面、20%猪油、0.5%胆固醇的高脂饲料，10%乙醇为其唯一饮料;从第3周起改为喂养含99.5%玉米面、0.5%胆固醇的饲料，第4周后乙醇浓度提高至15%，直至造模结束。四氯化碳给药采取皮下多点注射法，造模第1 d首次按每100g体重皮下注射60%四氯化碳0.5 mL，之后每隔3 d按每100 g体重皮下注射40%四氯化碳0.3 mL。第6周起给药间隔时间延长至7 d，剂量改为2 mL/kg，造模时间持续8周后模型形成。

2.2 肝硬化门静脉高压症模型大鼠实验干预 (1)实验分为3组:辛伐他汀治疗组11只，p38 MAPK抑制剂SB203580处理组10只，模型组10只;另设正常对照组8只(给予普通饮食)。(2)干预方法为:辛伐他汀组给予辛伐他汀 20 mg/kg，每天1次灌胃;SB203580组给予SB203580 1 mg/kg，每天1次灌胃;模型组给予等量蒸馏水灌胃。此外这3组继续给予造模饮食，共4周。

2.3 实验指标检测

2.3.1 大鼠血流动力学检测 造模及干预实验结束，大鼠禁食12 h，不禁饮水，右颈动脉插管测量平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)，门静脉插管测量PP。MAP和PP采用BL-410生物机能系统测量并记录。

2.3.2 大鼠肝功能检测 测压完后立即从门静脉采血，以2 000 r/min的速度离心20 min后取血清，－20℃贮存，检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(total bil-irubin，TBIL)、白蛋白(albumin，ALB)等肝功能指标。

2.3.3 大鼠肝脏组织学检测 取肝右叶组织，经10%甲醛固定，脱水，常规石蜡包埋，切片，4 μm厚度。采用HE染色检测大鼠肝脏组织学改变。

2.3.4 Western blotting 检测 p38 MAPK、磷酸化 p38 MAPK、eNOS及磷酸化eNOS蛋白表达变化 取液氮保存的大鼠肝脏组织100 mg，加入蛋白裂解液，制备组织总蛋白。测定蛋白浓度后，行SDS-PAGE电泳，转硝酸纤维素膜，用脱脂奶粉封闭。加入稀释的Ⅰ抗(抗p38 MAPK、抗磷酸化 p38 MAPK、抗 eNOS、抗磷酸化eNOS及抗β-actin)和辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，增强化学发光显影，凝胶成像系统扫描定量，分别计算各目标蛋白与β-actin的吸光度比值。

2.3.5 大鼠肝脏NO含量检测 取100 mg液氮保存的大鼠肝脏组织制备成组织匀浆，采用Griess重氮化反应方法测定NO含量，按照试剂盒说明操作。

3 统计学处理

计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0进行ANOVA或独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 造模结果

造模至第8周末，随机抽取3只正常及3只模型大鼠进行开腹测压，模型大鼠门静脉压力［(17.30±1.11)cmH2O］明显高于正常大鼠门静脉压力［(8.20 ±1.10)cmH2O］(P ＜0.01)，与 Trebicka等［4］报道相似，表明门静脉高压症形成。正常大鼠肝脏外观色泽红润，表面光滑，无黏连，见图1A;模型大鼠肝脏大体观色泽暗，表面油腻、欠光滑，有黏连，部分肝缘变钝或呈锯齿状，见图1B。上述结果表明造模成功。

Figure 1.Hepatic morphology of normal control(A)and model(B)rats图1 正常对照组和模型组大鼠肝脏大体形态

2 肝硬化门静脉高压症模型大鼠干预实验结果

2.1 血流动力学检测结果 干预结束，测压结果显示，辛伐他汀治疗组及SB203580处理组PP均明显低于模型对照组(P＜0.01)，辛伐他汀治疗组PP也明显低于SB203580处理组(P＜0.01)。上述3组间MAP比较无显著差异(P＞0.05)，见表1。

表1 辛伐他汀对肝硬化门静脉高压症模型大鼠血流动力学的影响Table 1.Effect of simvastatin on hemodynamics in rats with cirrhosis and portal hypertension(mean±SD)

2.2 肝功能检测结果 辛伐他汀治疗组、SB203580处理组及模型组ALT、AST和TBIL水平均明显高于正常对照组(P＜0.01)，而ALB水平均明显低于正常对照组(P＜0.01)。辛伐他汀治疗组、SB203580处理组及模型组3组之间ALT、AST、TBIL及ALB水平无明显差异(P＞0.05)，见表2。

表2 辛伐他汀对肝硬化门静脉高压症模型大鼠肝功能的影响Table 2.Effect of simvastatin on liver function in rats with cirrhosis and portal hypertension(mean±SD)

2.3 肝脏组织学改变 正常对照组大鼠肝小叶结构正常，肝窦形态正常(图2A)。模型组(图2B)大鼠肝细胞脂肪变性明显，大量纤维增生形成假小叶，假小叶内肝细胞排列紊乱，中央静脉缺如，肝窦形态失常，纤维间隔内有大量炎症细胞浸润。辛伐他汀治疗组(图2C)及SB203580处理组(图2D)大鼠肝脏组织学外观与模型对照组相比，除肝细胞脂肪变性减轻外，其余表现与模型对照组相似。

Figure 2.Histological changes of rat hepatic tissues(HE staining，× 200).A:normal control group;B:model group;C:simvastatin treatment group;D:SB203580 treatment group.图2 各组大鼠肝脏组织学变化

2.4 Western blotting结果 与正常大鼠相比，模型组大鼠肝脏总p38 MAPK及总eNOS蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05)，而磷酸化p38 MAPK蛋白及磷酸化eNOS蛋白表达水平分别增高与降低(P＜0.01)。与模型组比较，辛伐他汀治疗组大鼠肝脏总p38 MAPK蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05)，总eNOS蛋白表达水平增高(P＜0.01)，而磷酸化p38 MAPK蛋白及磷酸化eNOS蛋白表达水平分别降低与增高(P＜0.01);SB203580处理组大鼠肝脏总p38 MAPK蛋白及总eNOS蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05)，而磷酸化p38 MAPK蛋白及磷酸化eNOS蛋白表达水平分别降低与增高(P＜0.01)，但磷酸化eNOS蛋白表达水平增高的程度低于辛伐他汀治疗组(P ＜0.01)，见图3。

2.5 大鼠肝脏NO含量检测结果 辛伐他汀治疗组［(15.73 ±1.59)μmol/(g protein)］及 SB203580处理组［(13.98 ±1.27)μmol/(g protein)］肝脏组织NO含量明显高于模型组［(9.81±1.12)μmol/(g protein)］(P＜0.01)，辛伐他汀治疗组也高于SB203580处理组(P＜0.01)，但上述3组NO含量均低于正常对照组［(18.70 ±1.85)μmol/(g protein)］(P ＜0.01)。

讨 论

Figure 3.Western blotting analysis of total p38 MAPK，p-p38 MAPK，total eNOS，and p-eNOS protein expression in hepatic tissues of rats.Mean ± SD.n=8 ～ 11.＊＊P ＜0.01 vs normal control;##P ＜0.01 vs model;△△P ＜0.01 vs SB203580.图3 4组大鼠肝脏Western blotting分析结果

他汀类药物是3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶抑制剂，可以阻断HMG-CoA转变为甲羟戊酸，从而显著减少胆固醇的合成，是目前临床上广泛使用的降脂药。近年来研究发现，他汀类药物还有多种非降脂作用。Zafra等［5］用辛伐他汀治疗肝硬化患者，发现它能够增加肝脏内NO释放，降低肝内血管阻力。Trebicka等［4］研究显示，阿托伐他汀可降低肝硬化大鼠肝内血管阻力，从而降低门静脉压力，而且不影响平均动脉压。最近，Abraldes等［2］报道了一项随机、双盲、安慰剂对照临床研究，以评价连续应用(1个月)辛伐他汀对肝硬化门静脉高压症患者肝静脉压力梯度(hepatic venous pressure gradient，HVPG)的影响及其安全性，结果显示，辛伐他汀可显著降低HVPG及改善肝脏灌注，且对全身血流动力学无明显影响，其不良事件的发生频率与安慰剂组相似，表明辛伐他汀确实可降低肝硬化患者的门静脉压力。

研究显示，他汀类药物降低肝硬化门静脉压力的机制涉及以下方面:肝硬化时，肝脏RhoA/Rho激酶信号通路活化，引起eNOS抑制，使肝内NO产生减少;他汀类药物是HMG-CoA还原酶抑制剂，可抑制胆固醇及其生物合成过程中的中间代谢产物类异戊二烯的合成，后者是引起小分子单体 G蛋白(RhoA、Ras、Rac等)激活的关键分子。这样，他汀类药物可通过抑制类异戊二烯的合成而显著降低RhoA/Rho激酶信号通路的活性，引起肝内 eNOS mRNA及蛋白表达水平上调［4］;另一方面，RhoA/Rho激酶信号通路活性的抑制可激活PI3K/Akt通路，引起eNOS磷酸化而上调其活性［8］。因此，他汀类药物可通过提高eNOS的表达水平及上调其活性2个方面增加肝脏NO释放。但他汀类药物增加肝硬化肝内NO产量是否还涉及其它信号通路如p38 MAPK通路活性的改变，目前尚不清楚。

在本研究中，我们采用四氯化碳复合因素法构建大鼠肝硬化门静脉高压症模型，造模成功后给予辛伐他汀干预处理，干预结束，我们取得了一系列实验结果。第一，与正常大鼠相比，肝硬化门静脉高压症模型大鼠肝脏p38 MAPK信号通路发生了活化，这与 Deng 等［9］及 Tsukada等［10］的研究结果相似，他们发现p38 MAPK信号通路活化参与了肝纤维形成。第二，辛伐他汀及 p38 MAPK特异性抑制剂SB203580均可明显降低肝硬化门静脉高压症模型大鼠PP，且辛伐他汀的降压作用强于SB203580，对全身血流动力学无影响，这提示辛伐他汀降低肝硬化门静脉压力的机制除了与前述的RhoA/Rho激酶及PI3K/Akt通路活性改变相关外［4，8］，还可能涉及 p38 MAPK通路活性的抑制。第三，辛伐他汀及SB203580均可明显降低肝硬化门静脉高压症模型大鼠肝脏p38 MAPK通路活性，上调eNOS蛋白活性，增加肝脏内NO产生，且辛伐他汀的作用强于SB203580，进一步提示辛伐他汀增加肝硬化大鼠肝脏NO的产量可能涉及多条信号通路活性的改变，其中包括p38 MAPK信号通路活性的抑制。第四，辛伐他汀及SB203580处理对肝硬化门静脉高压症模型大鼠血清ALT、白蛋白等肝功能指标及肝脏组织学改变无明显改善作用，此结果与Abraldes等［2］及Trebicka等［4］的报道相似。

总之，本研究提示，p38 MAPK信号通路活化参与了肝硬化模型大鼠门静脉高压症的形成，辛伐他汀可降低其门静脉压力，其机制可能还涉及 p38 MAPK信号通路活性的抑制，进而上调eNOS活性，使肝脏NO产生增加，从而引起大鼠门静脉压力降低。

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