siRNA沉默WT1对小鼠足细胞Wnt/β-catenin和nephrin表达的影响*

周 静， 袁伟杰△， 谢院生， 陈香美

流行病学调查显示，与1988～1994年间相比，2005～2010年间美国慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的患病率由 12.3% 增加至 14.0%;与2009年相比，2010年末美国发生终末期肾脏病(endstage renal disease，ESRD)的患者年发生率增加了约4%［1］。蛋白尿是 CKD患者的常见临床表现。其中，肾小球滤过屏障受损尤其是裂孔隔膜受损是蛋白尿发生的主要原因。Nephrin作为免疫球蛋白超家族的跨膜成分，是肾小球裂孔隔膜的重要组成部分。损伤性刺激如糖代谢紊乱等可抑制肾小球nephrin的表达并诱导蛋白尿的发生，而维持足细胞nephrin的正常表达则可阻断糖尿病肾病的进展［2-3］。有证据表明，Wnt/β-catenin通路异常激活可诱导足细胞nephrin分子表达下调和蛋白尿的发生，阻断该通路的表达则会减轻足细胞损伤［4］。新近研究发现，Wnt/β-catenin通路的表达变化主要由WT1的负调控作用所致［5］。因此，本研究旨在进一步探讨WT1与Wnt/β-catenin通路在足细胞损伤中的作用及关系。

材料和方法

1 细胞

条件永生化小鼠足细胞是从H-2Kb-tsA58转基因小鼠肾脏中分离后建立的细胞系，由美国Mount Sinai医学院Mundel教授赠送。

2 主要试剂

RPMI-1640培养液(Gibco)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS;Gibco)，I型胶原蛋白(Sigma)，小鼠重组干扰素 γ(interferon-γ，IFN-γ;PeproTech)，JetPRIMETM转染试剂 (Polyplus)，兔抗小鼠单克隆WT1抗体(Abcam)，siRNA靶序列和siRNA对照序列(上海吉玛)，羊抗小鼠多克隆nephrin抗体(RD)，兔抗小鼠单克隆Wnt1抗体(嘉美生物)，小鼠抗人多克隆β-catenin抗体 (Santa Cruz)，兔抗小鼠单克隆 p-βcatenin抗体 (Cell Signaling)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG和驴抗山羊IgG(上海碧云天生物技术有限公司)，Trizol试剂(Invitrogen)。

3 主要方法

3.1 足细胞培养 足细胞培养方法参照文献［6］。用含10%FBS的RPMI-1640培养基(添加小鼠重组IFN-γ)33℃条件下传代培养足细胞，以含10%FBS的RPMI-1640培养基(不含IFN-γ)在37℃条件下诱导足细胞分化。

3.2 足细胞转染及分组 转染WT1 siRNA:将足细胞接种于25 cm2的培养瓶中，当细胞融合度达到50%～60%时进行转染。足细胞分成以下3组:未转染组:未经任何处理的足细胞;阴性对照组:转染negative control组;转染组:转染WT1 siRNA组。利用JetPRIMETM进行转染。转染方法参照JetPRIMETM转染试剂的说明书。转染24 h及48 h后，分别采用real-time qRT-PCR和Western blotting法检测WT1 mRNA和蛋白的表达情况，从而明确WT1 siRNA的转染效率。阴性对照序列:正义链 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反 义 链 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3';WT1 siRNA的序列:正义链 5'-CUACAGCAGUGACAAUUUATT-3'，反义链 5'-UAAAUUGUCACUGCUGUAGTT-3'，均由上海吉玛公司负责合成。

3.3 Real-time qRT-PCR 用Trizol试剂(Invitrogen)抽提细胞总RNA，用逆转录试剂盒(Promega)进行逆转录反应合成cDNA，以此cDNA为模板，进行扩增。采用荧光染料法，按照说明书进行操作，以GAPDH为内参照。引物设计参照GenBank中的mRNA序列，由北京赛百盛基因技术有限公司合成见表1。采用ΔΔCt法进行相对定量。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.4 Western blotting RIPA裂解液裂解细胞，4℃12 000×g离心30 min，提取细胞总蛋白。BCA试剂盒测定蛋白浓度，每组取60 μg蛋白上样于10%SDS-PAGE电泳分离，电转至PVDF膜，1×casein封闭约 1 h，分别加入 I抗(WT1、Wnt1、β-catenin、p-βcatenin及nephrin)，4℃过夜。辣根过氧化物酶标记的II抗37℃孵育1 h。利用UVP化学荧光成像系统(ChemiDoc-ItTM600 Imaging System)进行化学发光显影，以β-actin作为内参校正。

3.5 MTT检测细胞活力 收集对数生长期细胞，按4 400 cells/well接种于96孔板，各组干预方法同上述实验。培养板充分吸尽上清后，每孔加入10 μL MTT溶液，继续培养4 h后终止培养。每孔加入100 μL二甲基亚砜，置摇床上低温振荡10 min，酶标仪测量各孔A490。

4 统计学处理

计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析。采用 SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 WT1 siRNA转染足细胞的效率

转染12 h后，与未转染组和对照组细胞相比，siRNA沉默WT1基因组细胞内mRNA水平显著下降(P＜0.05)，转染阴性对照组和未转染组的胞内WT1 mRNA的水平无显著差异。与未转染组细胞相比，WT1 mRNA 下降了约 69.6%(P ＜0.05)，见图 1;转染24 h后，siRNA沉默WT1基因组细胞内WT1蛋白表达水平与未转染组和阴性对照组相比显著下降(P＜0.05)，转染阴性对照组和未转染组的胞内WT1蛋白表达水平无明显差异。与未转染组细胞相比，转染组细胞WT1蛋白的表达水平下降了约61%(P＜0.05)，见图 1、2。

Figure 1.Effect of RNA interference on WT1 mRNA expression detected by real-time qRT-PCR.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs non-transfection.图1 转染siRNA对WT1 mRNA表达的影响

Figure 2.Effect of RNA interference on WT1 protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 1.图2 转染siRNA对WT1蛋白表达的影响

2 siRNA沉默对胞内Wnt1水平的影响

未转染组、阴性对照组和siRNA转染组的小鼠足细胞转染36 h后，Wnt1 mRNA表达水平较未转染组细胞有显著增加(P＜0.05);转染48 h后，Wnt1蛋白表达水平较未转染组细胞有显著增多(P＜0.05)，见图3、4。

Figure 3.Effect of RNA interference on Wnt1 mRNA expression detected by real-time qRT-PCR.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs non-transfection.图3 WT1沉默对足细胞Wnt1 mRNA水平的影响

Figure 4.Effect of RNA interference on Wnt1 protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 1.图4 WT1沉默对Wnt1蛋白水平的影响

3 siRNA沉默WT1基因对胞内β-catenin水平的影响

未转染组、阴性对照组和siRNA转染组的小鼠足细胞转染36 h后，β-catenin mRNA表达水平无明显改变;转染48 h后，p-β-catenin蛋白的表达水平较未转染组细胞有显著下降(P＜0.05)，见图5～7。

4 siRNA沉默对足细胞活力的影响

siRNA沉默WT1基因的小鼠足细胞在转染24 h后，siRNA转染组与未转染组相比，细胞活力无明显变化;在转染48 h后，与未转染组细胞相比，转染组细胞活力明显下降(P＜0.05)，见表2。

5 WT1沉默对小鼠足细胞nephrin mRNA的影响

siRNA沉默WT1基因的小鼠足细胞在转染36 h后，nephrin mRNA表达水平较未转染组细胞有显著下降(P ＜0.05)，见图8。

6 WT1沉默对nephrin蛋白水平的影响

siRNA沉默WT1基因的小鼠足细胞在转染48 h后，nephrin蛋白表达水平较未转染组细胞有显著下降(P ＜0.05)，见图9。

Figure 5.Effect of RNA interference on β-catenin mRNA expression detected by real-time qRT-PCR.Mean±SD.n=3.图5 WT1沉默对足细胞β-catenin mRNA水平的影响

Figure 6.Effect of RNA interference on β-catenin protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.图6 WT1沉默对足细胞β-catenin蛋白水平的影响

Figure 7.Effect of RNA interference on p-β-catenin protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 1.图7 WT1沉默对足细胞p-β-catenin蛋白水平的影响

表2 MTT法检测WT1沉默后足细胞的活力Table 2.Effects of WT1 siRNA on podocyte vitality detected by MTT assay(mean±SD.n=3)

Figure 8.Effect of RNA interference on nephrin mRNA expression in mouse podocytes detected by real-time qRTPCR.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs non-transfection.图8 WT1沉默对足细胞nephrin mRNA水平的影响

Figure 9.Effect of RNA interference on nephrin protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 1.图9 WT1沉默对足细胞nephrin蛋白水平的影响

讨 论

足细胞受损是慢性肾脏病发生发展的主要原因，其损伤程度可作为判断慢性肾脏病预后的重要指标。由于对其损伤机制研究的有限性，我们目前对于足细胞的靶向治疗仍处于探索阶段。现今临床常用治疗方案并不能阻止肾脏疾病的进展。因此，阐明足细胞损伤修复的分子机制具有重要的临床意义和实用价值。

WT1基因是一种具有双重作用的转录调控因子，除参与肿瘤的发生外，其在足细胞发生发育及足细胞功能的维持上发挥重要作用［7］。研究发现，WT1可通过负调控Wnt/β-catenin通路的表达发挥其病理生理作用［5］。Wnt/β-catenin通路作为一条比较保守的信号通路可参与肿瘤的发生［8］。近年来，其慢性肾脏病发生发展中的作用逐渐被人们所认识。有证据表明，在糖尿病肾病或局灶阶段性肾小球硬化的患者足细胞中可见Wnt1和β-catenin的高表达，异常升高的Wnt1或β-catenin可抑制nephrin的表达诱导足细胞损伤［9-10］。本研究结果显示，在沉默WT1的表达后，足细胞内Wnt1分子表达明显上调，提示Wnt/β-catenin通路可能处于激活状态。

既往人们对肾母细胞瘤的研究中发现，WT1基因突变常伴有β-catenin在胞核内的大量蓄积［11］。β-catenin作为Wnt/β-catenin通路的关键调控因子，其表达水平主要受胞浆内破坏复合体(destruction complex)的调控。当Wnt/β-catenin通路处于激活状态时，破坏复合体解离，β-catenin可在胞浆内大量蓄积，启动下游基因的表达［12］。研究发现，β-catenin在正常足细胞结构与功能维持中发挥的作用较小，但其在介导阿霉素诱导小鼠足细胞损伤过程中至关重要［13］。在本实验中，与未转染组细胞相比，siRNA干扰组细胞内 β-catenin水平无明显变化，而 p-βcatenin水平降低，提示β-catenin的降解减少并在胞浆内积聚并进入细胞核调控下游基因的表达，这一发现进一步说明了足细胞内Wnt/β-catenin信号通路在siRNA沉默WT1基因表达后处于激活状态。为明确足细胞损伤程度，我们进一步检测了足细胞活力与裂孔隔膜相关分子nephrin的表达水平变化，结果表明，与未转染组细胞相比，转染组细胞活力明显下降;同时，其足细胞内nephrin mRNA和蛋白的表达水平均明显下调。如前文所述，Wnt/β-catenin通路激活后可诱导肿瘤细胞增殖，但本研究并未发现足细胞增殖能力增强，可能与分化成熟的足细胞分裂增生能力有限或足细胞内nephrin分子表达下调后其结构或功能受损所致。因此，我们可以推测，转录因子WT1可通过负调控Wnt/β-catenin通路的表达诱导足细胞损伤。

综上所述，通过siRNA沉默WT1基因的表达后会使其对Wnt/β-catenin通路的抑制作用减弱，诱导处于静息状态的Wnt/β-catenin通路异常激活从而导致足细胞损伤及裂孔隔膜分子nephrin的表达下降。这一发现为慢性肾脏病的早期诊断和治疗开辟了新思路，同时也为新药研发或有效信号转导分子的干预研究提供了理论依据。

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