N-乙酰-L-半胱氨酸对慢性间歇性缺氧大鼠血压变化及内皮功能的影响*

刘 雪， 邓 燕， 尚 进， 杨秀红， 刘辉国， 徐永健

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)是临床上常见的综合征，慢性间断缺氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)是其主要的病理生理特征，与OSAHS所致的靶器官损害密切相关。流行病学调查显示，OSAHS与高血压相关密切，约50%～60%的OSAHS患者合并高血压，同时，约50%的高血压患者伴有OSAHS［1］。OSAHS与高血压不仅具有相关关系而且还存在因果关系，内皮功能失调是引发心血管疾病包括高血压病的重要病理生理基础［2］，主要表现为血管内皮细胞合成、释放舒血管活性因子如一氧化氮(nitric oxide，NO)、前列环素等及缩血管活性因子如内皮素1(endothelin-1，ET-1)、黏附分子等功能失调，从而导致血管张力、血管平滑肌增殖等调控功能异常，其中最为重要因素为ET-1和NO的水平失衡。多项临床研究证实，OSAHS合并高血压患者血清ET-1和NO水平不同于正常对照组［3-5］。因此，我们采用大鼠间歇缺氧模型，模拟OSAHS患者存在的间歇缺氧的病理生理过程，同时选用抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸 (N-acetyl-L-cystein，NAC)干预，观察大鼠的尾动脉收缩压、主动脉内皮功能和血清氧化应激指标的变化，从而探讨CIH导致高血压时的血管内皮功能及其相关机制。

材料和方法

1 慢性间歇缺氧大鼠模型的建立和分组

随机将30只体重为180～200 g的8周龄雄性健康SD大鼠(华中科技大学同济医学院动物中心提供)分为正常对照组﹑CIH组和NAC干预CIH组，每组10只。参考文献的方法［6］，自制密闭的有机玻璃间歇缺氧箱，按气体流动方向设置进气﹑出气孔，从进气孔向密闭缺氧箱中循环充入氮气和压缩空气，每一个循环过程为110 s，即55 s充入氮气，随后55 s充入压缩空气，用数字测氧仪(上海市嘉定学联仪表厂)检测缺氧箱中的氧浓度，调节气流流量，目的是使每一个循环缺氧箱内的最低氧浓度能达到7% ～8%，持续约30～40 s，然后逐渐恢复到21%左右，持续约30～40 s。充入氮气和压缩空气之间的转换通过定时电磁阀来完成。CIH组大鼠置于间歇缺氧箱中，每天持续8 h，共4周。正常对照组大鼠置于相同的缺氧箱中，但不给予缺氧处理。NAC治疗组每日在间歇缺氧前给予NAC(意大利赞邦集团)300 mg/kg灌胃，CIH组及正常对照组给予等体积生理盐水灌胃。

2 大鼠尾动脉收缩压的测定

选取造模前1 d和造模结束第2 d的尾动脉收缩压作为测定结果，正式测量前10 d需每天测量大鼠尾动脉血压。尾动脉收缩压的具体测定方式参照文献方法并加以改进［7-8］。具体操作如下:在安静环境中，将大鼠放入用白布制作的鼠袋内，把大鼠尾压测量仪(华中科技大学同济医学院心内科实验室提供)的尾部气囊和脉搏换能器依次套于大鼠尾部的近心端，换能器的表面对准大鼠尾腹面，换能器与心电图的肢体导联相连，用电吹风加热大鼠尾部，小心调整鼠尾和换能器接触部位，当心电图机描记出等幅规律摆动的脉搏波动时给气囊加压，阻断大鼠尾动脉搏动后放气，当心电图机上重新出现脉搏波时测压仪压力表上的读数(mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)即为大鼠的尾动脉收缩压。每只大鼠反复测量3次，取平均值。

3 血液和组织样品的采集和处理

3.1 血液样品的采集和处理 用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠成功后，给予注射肝素钠(1×105U/L)0.5 mL，沿腹中线切开皮肤，腹主动脉取血，置于肝素化的离心管中，3 000 r/min离心20 min，分离出血浆，于－20℃存放待测。

3.2 组织样品的采集和处理 取血后迅速开胸，分离主动脉，用100 mL生理盐水快速灌注冲洗血液，取出胸主动脉，然后迅速在手术显微镜下去除残余血管鞘脂肪与周围结缔组织并剥离血管外膜，生理盐水清洗，滤纸吸干后称重100 mg，制成10%动脉匀浆，3 000 r/min离心10 min后去上清，保存于－20℃待测。另一部分新鲜离体血管立即将其置于无RNase的冻存管中－80℃冻存，用于mRNA的检测等。

4 实时荧光定量PCR测定胸主动脉内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和ET-1 mRNA的表达

取100 mg血管组织加入Trizol(Invitrogen)1.0 mL研磨匀浆充分裂解，室温静置5 min;加入氯仿1/5体积，4℃、12 000 r/min离心15 min，抽取上清约500～600 μL，加入等体积异丙醇混匀，冰上静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，75%乙醇1 mL洗涤2次，4℃ 12 000 r/min离心5 min，弃上清，室温放置5 min，加 DEPC水30 μL，立即保存液氮或者测RNA浓度。按逆转录试剂盒(TaKaRa)说明书合成cDNA;real-time PCR按照SYBR Green real-time PCR Master mix(TaKaRa)说明书进行。eNOS上游引物5’-GAT CCA GTG GGG GAA ACT G-3’，下游引物5’-TGT GGT TAC AGA TGT AGG TGA ACA-3’;ET-1上游引物5’-AAG CGT TGC TCC TGC TCC TCC-3’，下游引物 5’-TTC CCT TGG TCT GGT CTT TGT G-3’。内参照 β-actin上游引物5’-CCA ACC GTG AAA AGA TGA CC-3’，下游引物 5’-ACC AGA GGC ATA CAG GGA CA-3’。反应条件(ABI PRISM 7500 real-time PCR仪):95℃预变性30 s后，95℃ 5 s，64℃ 34 s，共40次循环，每个循环后采集荧光生成扩增曲线。在同一次反应中，各组均设3个平行重复;反应结束后，设定阈值，软件输出Ct值;根据比较Ct值公式，获得不同组间基因表达比值，具体公式为:2－ΔΔCt，其中 ΔΔCt= ΔCt实验组－ΔCt对照组，ΔCt=Ct目的基因－Ct管家基因

5 Western-blotting检测eNOS蛋白表达

取冰冻血管组织，按组织蛋白抽提试剂盒说明书(武汉谷歌生物公司)提取大鼠胸主动脉匀浆蛋白，按Bradford法测蛋白含量，调整蛋白浓度，经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，Ⅰ抗(武汉博士德公司)孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗孵育2 h，化学发光法显色，βactin为内对照。用eNOS与β-actin条带的吸光度比表示eNOS蛋白相对表达量。

6 血清中NO和ET-1水平以及胸主动脉ET-1和超氧阴离子(superoxide anion，O－·2)水平的检测

采用放射免疫法测定血清及胸主动脉ET-1水平;采用硝酸还原酶法测定血清中NO含量，二者均严格按照试剂盒(南京建成自由基测试盒)说明检测。组织匀浆超氧阴离子的测定采用NBT还原法，新鲜离体血管制备成1%主动脉组织匀浆立即检测，按照(南京建成自由基测试盒)说明检测。

7 血浆超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平的检测

采用黄嘌呤氧化酶法测定外周血浆SOD活性，采用硫代巴比妥酸法测定外周血浆MDA含量，二者均严格按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书的步骤进行检测。

8 统计学处理

应用SPSS 17.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠尾动脉收缩压比较

各组大鼠血压的变化差异有统计学意义(P＜0.05)。与正常对照组［(105.95 ±9.43)mmHg］相比，CIH 组大鼠尾动脉收缩压［(150.61 ±7.31)mmHg］明显增高(P＜0.01);而NAC 治疗组［(140.68±7.52)mmHg］较CIH组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 实验前后平均动脉压Table 1.Mean arterial blood pressure at the onset and the end of experiment(mmHg.Mean ± SD.n=10)

2 各组大鼠外周血清ET-1和NO含量的变化

CIH组大鼠血清 ET-1水平［(190.24+11.41)ng/L］明显高于正常对照组［(130.14 ±9.32)ng/L］，差异有统计学意义(P＜0.01);而NAC治疗组［(169.42+11.01)ng/L］较 CIH 组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

CIH 组大鼠血清 NO水平［(26.54±5.13)μmol/L］明显低于正常对照组［(54.61 ±7.10)μmol/L］，差异有统计学意义(P＜0.01);而NAC治疗组［(35.76 ±6.28)μmol/L］较 CIH 组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

3 各组大鼠胸主动脉eNOS和ET-1 mRNA表达的变化

CIH组 eNOS mRNA 表达(0.45±0.12)明显低于正常对照组(1.00±0.13)，差异具有统计学意义(P＜0.01);NAC 治疗组(0.63±0.09)明显高于CIH组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

CIH组ET-1 mRNA 表达(2.01±0.21)明显高于正常对照组(1.00±0.12)，差异有统计学意义(P＜0.01);NAC 干预组(1.64±0.17)明显低于 CIH组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

4 各组大鼠胸主动脉eNOS和ET-1蛋白表达的变化

CIH 组 eNOS蛋白表达(0.18±0.03)明显低于正常对照组(0.60±0.02)，差异具有统计学意义(P＜0.01);NAC 治疗组(0.34 ±0.03)高于 CIH 组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

CIH 组ET-1 蛋白表达［(9.84 ±0.36)ng/L］明显高于正常对照组［(6.22± 0.30)ng/L］，差异有统计学意义(P ＜0.01);NAC干预组［(8.13±0.60)ng/L］明显低于CIH组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

5 氧化应激指标的测定

5.1 大鼠胸主动脉O－·2水平CIH组［(166.00±26.27)U/(g protein)］明显高于正常对照组［(103.5±23.29)U/(g protein)］，差异有统计学意义(P＜0.01);而NAC治疗组［(134.00±22.31)U/(g protein)］较CIH组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

Figure 1.The expression of eNOS protein in rat thoracic aorta.Mean±SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs CIH group.图1 大鼠胸主动脉eNOS水平

表2 各组大鼠胸主动脉eNOS mRNA、ET-1 mRNA、ET-1蛋白以及循环中ET-1和NO水平的比较Table 2.The eNOS mRNA，ET-1 mRNA and ET-1 protein in thoracic aorta，and the circulating levels of ET-1 and NO among the three groups(mean±SD.n=10)

5.2 大鼠外周血血浆中MDA含量CIH组［(3.07±0.68)μmol/L］明显高于正常对照组［(1.86±0.57)μmol/L］，差异有统计学意义(P＜0.01);而NAC治疗组［(2.84±0.69)μmol/L］较CIH组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

5.3 大鼠外周血浆 SOD活性 CIH组［(90.94±17.79)×103U/L］明显低于正常对照组［(151.67±20.63)×103U/L］，差异有统计学意义(P＜0.01);而NAC治疗组SOD活性［(124.30±15.85)×103U/L］较 CIH组明显升高，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见表3。

表3 大鼠氧化应激指标的变化Table 3.The oxidative stress indexes among the three groups(mean±SD.n=10)

讨 论

近年来，OSAHS与高血压的相关关系已经得到公认，OSAHS为年龄、性别、肥胖、吸烟、酗酒、生活压力及心脏、肾脏疾病以外的高血压发病的独立危险因素［1］。在OSAHS患者合并高血压和血管合并症的发病机制中，反复缺氧/复氧造成氧化应激和内皮功能障碍发挥了关键作用［9］。本实验研究证明间歇性缺氧造成大鼠尾动脉收缩压升高、氧化应激损伤和血管活性因子分泌失衡。然而，间歇缺氧导致氧化应激和内皮功能失调导致高血压发生的确切机制还不清晰。

已证实氧化应激与OSAHS存在密切关系［10］，Xu等［11］和我们既往研究［12-13］也均证实在脑组织和主动脉间歇缺氧也可增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平。eNOS作为内皮源性血管舒张因子NO表达的限速性因素，催化左旋精氨酸合成NO，此过程为氧依赖过程。低氧和氧化应激可抑制eNOS基因转录速率及其mRNA稳定性，限制NO协同因子产生，直接影响血管床NO形成及释放。CIH在转录及转录后水平都对eNOS有抑制作用［14-15］。Jelic等［15］的临床研究发现，OSAHS患者由于氧化应激和炎症使NO利用率和修复能力下降，从而直接损伤血管内皮功能。

ET-1是至今发现的最强的内皮源性血管收缩因子［16］。Kanagy等［17］认为暴露在间歇缺氧的大鼠血压升高依赖于血清中升高的ET-1。Peng等［18］研究报道，间歇缺氧的小鼠中氧化应激和高血压存在相关性，间歇缺氧产生大量ROS，特别是O－·2，对ET-1依赖的高血压有必要作用;同时，氧化应激产生的ROS可诱导ET-1的产生，ET-1通过前反馈活化内皮素受体A，激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶［19］，使ROS产生增加，然而其详细机制目前不清楚。Troncoso-Brindeiro等［20］研究认为，ROS的增加是ET-1产生的上游，而非下游。因此，我们推测氧化应激参与内皮舒缩功能变化，引起内皮功能紊乱，导致高血压病的发生。

NAC作为一种强有力的抗氧化剂，不仅具有清除自由基功能，本身亦可转化合成强抗氧化应激物质谷胱甘肽［21］。因此我们采用NAC进行抗氧化应激作用的干预。本研究结果表明，NAC干预CIH组与CIH组比，eNOS mRNA和蛋白水平合成明显增加，ET-1 mRNA和蛋白合成降低，同时外周血清NO升高，ET-1降低。NAC干预CIH组外周血SOD活力增高，而MDA、超氧阴离子含量以及尾动脉收缩压均较CIH组明显降低。推测NAC干预CIH氧化应激状态，使ROS产生降低，一方面，eNOS合成增多，ROS直接灭活NO的作用减弱，NO依赖的血管扩张作用增强;另一方面，NAC使ET-1合成减少，外周血清ET-1减低，血管收缩功能减缓，从而导致血压降低。由此可见，NAC具有抗氧化和保护血管内皮的功能，可防治慢性间歇缺氧导致心血管并发症的发生。

［1］ Silverberg DS，Oksenberg A.Are sleep-related breathing disorders important contributing factors to the production of essential hypertension?［J］.Curr Hypertens Rep，2001，3(3):209-215.

［2］ Luscher TF.The endothelium and cardiovascular disease:a complex relation［J］.N Engl J Med，1994，330(15):1081-1083.

［3］ Gjorup PH，Sadauskiene L，Wessels J，et al.Abnormally increased endothelin-1 in plasma during the night in obstructive sleep apnea:relation to blood pressure and severity of disease ［J］.Am J Hypertens，2007，20(1):44-52.

［4］ Jordan W，Reinbacher A，Cohrs S，et al.Obstructive sleep apnea:Plasma endothelin-1 precursor but not endothelin-1 levels are elevated and decline with nasal continuous positive airway pressure［J］.Peptides，2005，26(9):1654-1660.

［5］ Schulz R，Schmidt D，Blum A，et al.Decreased plasma levels of nitric oxide derivatives in obstructive sleep apnoea:response to CPAP therapy ［J］.Thorax，2000，55(12):1046-1051.

［6］ Neubauer JA.Invited review:Physiological and pathophysiological responses to intermittent hypoxia［J］.J Appl Physiol，2001，90(4):1593-1599.

［7］ Garcia-Covarrubias L，Manning EW 3rd，Sorell LT，et al.Ubiquitin enhances the Th2 cytokine response and attenuates ischemia-reperfusion injury in the lung［J］.Crit Care Med，2008，36(3):979-982.

［8］ Sampaio RC，Tanus-Santos JE，Melo SE，et al.Hypertension plus diabetes mimics the cardiomyopathy induced by nitric oxide inhibition in rats［J］.Chest，2002，122(4):1412-1420.

［9］ Atkeson A，Yeh SY，Malhotra A，et al.Endothelial function in obstructive sleep apnea ［J］.Prog Cardiovasc Dis，2009，51(5):351-362.

［10］ Wysocka E，Cofta S，Cymerys M，et al.The impact of the sleep apnea syndrome on oxidant-antioxidant balance in the blood of overweight and obese patients［J］.J Physiol Pharmacol，2008，59(Suppl 6):761-769.

［11］ Xu W，Chi L，Row BW，et al.Increased oxidative stress is associated with chronic intermittent hypoxia-mediated brain cortical neuronal cell apoptosis in a mouse model of sleep apnea［J］.Neuroscience，2004，126(2):313-323.

［12］ Liu HG，Liu K，Zhou YN，et al.Effect of NADPH oxidase activity inhibitor apocynin on blood pressure in rats exposed to chronic intermittent hypoxia and the possible mechanisms［J］.Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi，2008，31(12):921-925.

［13］ Liu H，Liu K，Zhou Y et al.Apocynin attenuate spatial learning deficits and oxidative responses to intermittent hypoxia［J］.Sleep Med，2010，11(2):205-212.

［14］ Suzuki YJ，Jain V，Park AM，et al.Oxidative stress and oxidant signaling in obstructive sleep apnea and associated cardiovascular diseases［J］.Free Radic Biol Med，2006，40(10):1683-1692.

［15］ Jelic S，Padeletti M，Kawut SM，et al.Inflammation，oxidative stress，and repair capacity of the vascular endothelium in obstructive sleep apnea［J］.Circulation，2008，117(17):2270-2278.

［16］周 晓，商战平，司艳红，等.槲皮素抑制内皮素－1诱导的人脐动脉平滑肌细胞T型钙通道的表达［J］.中国病理生理杂志，2011，27(3):450-454.

［17］Kanagy NL，Walker BR，Nelin LD.Role of endothelin in intermittent hypoxia-induced hypertension［J］.Hypertension，2001，37(2 Part 2):511-515.

［18］ Peng YJ，Yuan G，Ramakrishnan D，et al.Heterozygous HIF-1α deficiency impairs carotid body-mediated systemic responses and reactive oxygen species generation in mice exposed to intermittent hypoxia［J］.J Physiol，2006，577(Pt 2):705-716.

［19］ Pollock DM，Pollock JS.Endothelin and oxidative stress in the vascular system［J］.Curr Vasc Pharmacol，2005，3(4):365-367.

［20］ Troncoso-Brindeiro CM，da Silva AQ，Allahdadi KJ，et al.Reactive oxygen species contribute to sleep apnea-induced hypertension in rats［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(5):H2971-H2976.

［21］ Zafarullah M，Li WQ，Sylvester J，et al.Molecular mechanisms of N-acetylcysteine actions［J］.Cell Mol Life Sci，2003，60(1):6-20.