肺炎衣原体感染通过PI3K激活Rac1而诱导血管平滑肌细胞迁移*

张俊霞， 张腾腾， 张利军， 王蓓蓓， 魏俊燕， 王海伟， 沈炳玲， 张丽莙

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)引发的心脑血管疾病是目前人类死亡的首要原因，严重威胁人类健康。自Ross提出“AS是一种慢性炎症性疾病”［1］以来，感染性因素，尤其是肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae，C.pn)感染与AS的关系倍受关注［2-3］。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)由动脉壁中膜向内膜迁移是AS发病过程中的关键环节之一。研究表明，C.pn感染可以通过多种途径诱导细胞迁移［4-5］。Rac1是小G蛋白Rho家族成员，其通过GTP结合的有活性形式和GDP结合的无活性形式循环调节多种信号转导途径，在肌动蛋白细胞骨架重组、细胞迁移中发挥重要作用［6-7］。磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是具有催化活性的胞内信号蛋白，在细胞迁移等多种信号转导中发挥重要作用［8-9］，且与Rac1关系密切［10］。我们前期研究发现C.pn感染通过激活PI3K及其信号途径促进内皮细胞、VSMCs迁移［11-12］。C.pn感染是否能诱导VSMCs内Rac1活化并通过其调控VSMCs迁移，以及在此过程中PI3K是否对Rac1的活化发挥调节作用，目前尚不清楚。本研究以Rac1为着眼点，采用GST-pull down实验观察C.pn感染VSMCs后Rac1活性的变化，并使用PI3K特异性抑制剂进一步探讨PI3K对C.pn感染诱导VSMCs内Rac1活化的调节作用，为阐明C.pn感染诱导VSMCs迁移的相关分子机制及有效防治AS提供新思路。

材料和方法

1 材料

SD大鼠主动脉原代VSMCs为本课题组分离、培养并鉴定［13］;C.pn AR-39 株 (美国标准菌库，ATCC53592);DMEM细胞培养基(Gibco);胎牛血清(fetal bovine serum，FBS;Gibco);DEAE(Sigma);Glutathione Sepharose 4B(GE Heathcare);GST-PBD重组质粒为本实验室保存;感受态细菌E.coli BL21(北京全式金生物技术有限公司);异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)(Prommega);小鼠抗大鼠 Rac1抗体(BD);小鼠抗大鼠βactin抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司);辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(Jackson);Rac1抑制剂NSC23766(Merck);PI3K抑制剂LY294002(Prommega);BCA蛋白定量试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所);ECL发光液(江苏碧云天生物技术研究所);蛋白酶抑制剂(Thermo);羟基脲(Sigma);Transwell小室(Corning)。

2 方法

2.1 VSMCs的培养和实验分组 VSMCs用含10%FBS的DMEM在37℃、5%CO2恒温孵箱中培养，细胞生长至90%单层融合后，0.25%胰蛋白酶消化液消化传代，选择生长良好的3～8代细胞用于实验。实验分组如下:正常对照组、C.pn感染组、NSC23766组、NSC23766 +C.pn感染组、LY294002组和LY294002 + C.pn感染组。NSC23766组和NSC23766 + C.pn感染组、LY294002组 和LY294002+C.pn感染组的 VSMCs分别用 50 μmol/L NSC23766、25 μmol/L LY294002 37 ℃孵育1 h进行预处理。同时，迁移实验中使用羟基脲0.8 mmol/L预处理细胞12 h，消除细胞增殖对迁移实验结果的影响。

2.2 GST-PBD融合蛋白的表达及纯化 用成功构建的GST-PBD质粒转化感受态细菌E.coli BL21，按1∶1 000的比例接种于5 mL LB培养基中，37℃、150 r/min振荡培养至对数期(600 nm吸光度值为0.4～0.6)。挑取对数期细菌，按照1∶5 000的比例接种入100 mL LB培养基中培养过夜。次日加入IPTG(0.1 mmol/L)，28℃、130 r/min诱导蛋白表达3 h。4℃2 800 r/min离心30 min收集菌体，细菌裂解液(1%Triton X-100，1×PBS)重悬菌体沉淀，超声裂解。4℃、13 000 r/min离心10 min，取上清，每1 mL上清液加入50 μL Glutathione Sepharose 4B，4℃ 孵育过夜，1×PBS洗涤4次，置4℃备用。

2.3 GST-pull down实验检测VSMCs Rac1的活性

按照王蓓蓓等［13］的方法，在HEp-2细胞中增殖培养C.pn并感染VSMCs。感染24 h后，用含蛋白酶抑制剂的裂解液于冰上裂解细胞30 min，细胞刮刀刮取细胞，4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。取1.0 mg相应体积的蛋白样品与孵育后的Glutathione Sepharose 4B混合，4℃过夜。次日4℃、1 000 r/min离心5 min，同样条件洗涤4次，微量加样器吸干EP管内剩余液体，加入40 μL 1×上样缓冲液，煮沸10 min。随后，行12%SDS-PAGE并转印于PVDF膜。特异性抗体孵育检测目标蛋白，ECL发光液显影、定影后拍照，并用ImageJ软件进行条带灰度分析。

2.4 Wound-healing实验 将VSMCs接种至6孔板，90%融合后，同步化处理12 h，加入0.8 mmol/L羟基脲作用12 h，用无菌移液管尖在培养板单层细胞的相同位置划直线，造成“伤口”，PBS洗去脱落细胞。NSC23766预处理VSMCs 1 h后，接种感染复数(multiplicity of infection，MOI)为0.5 的 C.pn 并孵育24 h，显微镜下观察VSMCs从划痕处向中央爬行的面积，其面积大小表示VSMCs迁移能力强弱，每孔随机取6个视野进行观察并拍摄，应用图像分析软件ImageJ测量细胞迁移面积，计算平均值，行3次独立实验。

2.5 Transwell实验 将 VSMCs接种至6孔板，90%融合后，同步化处理12 h，加入0.8 mmol/L羟基脲作用12 h，NSC23766预处理VSMCs 1 h后，将MOI为0.5的C.pn悬液接种于VSMCs，感染16 h后制备细胞浓度为1.5×108/L的VSMCs悬液，取100 μL细胞悬液加入 Transwell上室中，下室加入含50%FBS的DMEM，8 h后室温下甲醇固定，结晶紫染色。倒置相差显微镜下每个小室随机选取6个视野进行拍摄，记录每个视野的穿膜细胞数，取平均值，行3次独立实验。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，3组以上样本均数比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 GST-PBD融合蛋白的诱导与纯化

使用GST-PBD重组质粒转化感受态细菌E.coli BL21，LB培养基中扩增，并通过IPTG诱导GST-PBD融合蛋白的表达，随后用Glutathione Sepharose 4B富集纯化。为了保证GST-PBD与GTP-Rac1的特异性结合，纯化表达GST-PBD蛋白的同时表达GST空载体。为鉴定并检测纯化蛋白的质量及浓度，将纯化得到的GST和GST-PBD蛋白经SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色，见图1，纯化得到的融合蛋白分子量正确，且浓度达到实验要求。

Figure 1.The purification of glutathione S-transferase(GST)-p21-binding domain of p21-activated kinase 1(PBD)(GST-PBD)fusion protein.M:protein marker;1:GST vector;2:GST-PBD fusion protein图1 纯化的GST-PBD融合蛋白

2 C.pn感染VSMCs前后Rac1活性的变化

VSMCs经C.pn感染24 h后提取总蛋白，并与经过鉴定达到实验要求的纯化融合蛋白孵育，GST-pull down实验检测C.pn感染前后GTP-Rac1变化;同时以GST空载体作为阴性对照。结果显示，C.pn感染组GTP-Rac1表达水平显著上调(P＜0.05)，且GST-PBD融合蛋白与GTP-Rac1特异性结合，此结果可真实反映细胞内Rac1的活化水平，见图2。

Figure 2.The C.pn infection-induced Rac1 activation detected by GST-pull down assay.1:control group;2:C.pn infection group;3:GST incubation with cell lyses.Mean ± SD.n=4.*P ＜0.05 vs control group.图2 C.pn感染诱导VSMCs Rac1的活化

3 C.pn感染诱导PI3K依赖的Rac1活性上调

我们前期研究结果显示PI3K/Akt在C.pn感染诱导的VSMCs迁移中发挥重要作用［11］。为证实PI3K在C.pn感染诱导的VSMCs Rac1活化中的作用，我们使用LY294002预处理VSMCs，进而采用GST-pull down实验检测GTP-Rac1的表达水平。结果显示，LY294002+C.pn感染组GTP-Rac1表达明显低于 C.pn感染组，差异有统计学意义(P＜0.05)。各组之间总Rac1的表达量无明显差别，见图3。

4 Rac1活化在C.pn感染诱导的VSMCs迁移中的作用

C.pn感染 VSMCs 24 h后，wound-healing实验中，C.pn感染组VSMCs向划痕中央迁移的面积明显大于正常对照组(P＜0.05)，NSC23766预处理后VSMCs的Rac1活性被抑制，NSC23766+C.pn感染组VSMCs向划痕中央迁移的面积显著小于C.pn感染组(P ＜0.05)，见图 4;Transwell实验中，C.pn感染组穿膜的VSMCs数明显高于正常对照组(P＜0.05)，而 NSC23766+C.pn 感染组 VSMCs的穿膜数明显低于 C.pn感染组(P ＜0.05)，见图5。

Figure 3.The role of PI3K in Rac1 activation in C.pn-infected VSMCs detected by GST-pull down assay.1:control group;2:C.pn infection group;3:LY294002 group;4:LY294002+C.pn infection group.Mean ±SD.n=4.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs C.pn infection group.图3 PI3K在C.pn感染诱导的VSMCs Rac1活化中的作用

Figure 4.The role of Rac1 activation in C.pn infection-induced migration of VSMCs detected by wound-healing assay.1:control group;2:C.pn infection group;3:NSC23766 group;4:NSC23766+C.pn infection group.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs C.pn infection group.图4 Wound-healing实验检测Rac1在C.pn感染诱导VSMCs迁移中的作用

Figure 5.The role of Rac1 activation in C.pn infection-induced migration of VSMCs detected by Transwell assay.1:control group;2:C.pn infection group;3:NSC23766 group;4:NSC23766+C.pn infection group.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs C.pn infection group.图5 Transwell实验检测Rac1在C.pn感染诱导VSMCs迁移中的作用

讨 论

近年来，C.pn感染作为AS新的危险因素日益受到关注。C.pn是一种严格细胞内寄生菌，经呼吸道侵入机体后感染其寄居部位(肺泡)的单核细胞［14］并以单核-巨噬细胞为载体经血行迁移至动脉壁，可感染内皮细胞、VSMCs及巨噬细胞等AS相关细胞［15］，参与AS的发生发展。本课题组前期已成功建立C.pn感染内皮细胞、VSMCs的模型，为进一步研究其致病机制奠定了基础。VSMCs由血管壁中膜迁向内膜在AS形成及进展中发挥重要作用。研究表明，C.pn感染可通过炎症介质及细胞因子的释放影响细胞迁移［4-5］。但是，C.pn感染 VSMCs后是否能通过增强VSMCs的内在动力系统来促进其迁移，目前鲜有报道。

细胞迁移与免疫监视、伤口愈合、AS、炎症反应、肿瘤转移等多种生理、病理过程相关，是一个紧密协调的过程。其中，“leading edge”处的质膜突起或片状伪足的延伸是细胞迁移的主要驱动力。研究表明，片状伪足的形成是由Rac1介导的［6-7］。C.pn感染又与Rac1关系密切，C.pn感染的单核细胞GTPRac1表达增加［16］。那么，C.pn感染 VSMCs后能否引起Rac1的活性变化，目前尚不清楚。为此，我们使用成功构建的GST-PBD质粒转化感受态细菌，扩增并诱导表达GST-PBD融合蛋白，特异性地与GTPRac1结合以检测细胞内Rac1的活性。实验结果显示C.pn感染后VSMCs Rac1的活性明显高于正常对照组。Gouëffic等［17］研究显示透明质酸可通过激活Rac1诱导VSMCs片状伪足形成进而促使细胞迁移。为了明确Rac1的活化在C.pn感染诱导的VSMCs迁移中的作用，我们使用 Rac1特异性抑制剂NSC23766(50 μmol/L)预处理 VSMCs，采用 woundhealing实验和Transwell实验观察VSMCs迁移能力的变化。实验结果显示，预处理组C.pn感染诱导的细胞迁移能力明显低于单纯C.pn感染组。Rac1抑制剂NSC23766通过与Rac1的鸟嘌呤核苷酸交换因子Trio和Tiom相互作用干扰Rac1的磷酸化，并不影响Rac1的表达水平。相关文献［18］及我们的预实验结果显示NSC23766(50 μmol/L)预处理可有效抑制Rac1的活化。这提示C.pn感染可能通过激活Rac1促进VSMCs迁移。

Rac1作为细胞信号转导中的分子开关，通过与GTP/GDP结合形式之间的转换，接受外部刺激并作用于细胞骨架或其靶蛋白，发挥生物学效应［7］。PI3K作为具有催化活性的胞内信号蛋白，在多种类型细胞迁移过程中发挥调控作用［8-9］。文献［16］报道，透明质酸诱导的Rac1活化依赖PI3K的活性。PI3K-Rac1信号通路在IL-8引起的内皮细胞迁移中也发挥重要作用［19］。我们前期研究发现PI3K/Akt在C.pn感染诱导的 VSMCs迁移中发挥重要作用［11］，PI3K 抑制剂 LY294002(25 μmol/L)可有效抑制C.pn感染诱导的细胞迁移。为进一步探讨C.pn感染的VSMCs中PI3K对Rac1活化的影响，我们使用LY294002预处理VSMCs，GST-pull down实验检测Rac1活性的变化。实验结果显示，与C.pn感染组相比，预处理组VSMCs GTP-Rac1表达明显降低，这提示在C.pn感染诱导的VSMCs迁移中Rac1的活化是PI3K依赖性的。有文献也报道，PI3K抑制条件下，胰岛素诱导的Rac1上调及质膜突起的形成受到抑制［20］。PI3K对Rac1活性的影响可能通过其与Rac1的鸟嘌呤核苷酸交换因子相互作用来实现［21］。

研究表明，活化的Rac1可以与IQGAP1相互作用并激活Arp2/3复合物、APC促进肌动蛋白聚合及细胞迁移［22］。Tang 等［23］报道胸腺素 β4通过增强IQGAP1/Rac1信号通路诱导结肠癌细胞迁移及临床转移。我们研究也发现IQGAP1可调控C.pn感染诱导的VSMCs黏附和迁移［24］。然而，在 C.pn感染诱导的VSMCs迁移过程中，Rac1与IQGAP1之间的相互关系目前尚不明确，有待于进一步研究。

综上所述，PI3K依赖的Rac1活化在C.pn感染诱导的VSMCs迁移中发挥重要作用，这一结果将为进一步阐明C.pn感染诱导VSMCs迁移的分子机制以及寻找抑制VSMCs迁移和有效治疗AS的途径提供新思路。

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