内质网应激诱导血管反应性降低与线粒体通透性转换孔开放的关系*

甘稼夫， 胡 畔， 刘良明

脓毒性休克存在血管低反应性，它严重影响了休克的复苏和治疗。休克后血管反应性降低的发生机制目前认为主要有受体失敏、膜超极化及钙失敏机制［1］，但针对上述机制研发的一些恢复血管反应性的药物效果却非常有限，提示可能还有其它调控因素参与血管低反应性的发生。基础研究显示内质网应激是细胞的一种自身保护性反应，但是严重或持续的内质网应激可通过线粒体通透性转换孔(mi-tochondrial permeability transition pore，MPTP)的开放诱导细胞凋亡［2］，该途径参与糖尿病、脂肪性肝炎、心脏病等多种慢性疾病的发生发展［3-4］。近年来，有关失血/创伤、休克等危急重症存在内质网应激的报道也日益增多。内质网应激是否参与休克后血管低反应性的发生，与MPTP有何种关系，尚无报道。本实验用大鼠盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)脓毒性休克模型，分别从整体动物模型和离体血管环水平研究了内质网应激是否可诱导血管反应性降低及其与MPTP的关系。

材料和方法

1 动物和试剂

SD大鼠体重(210±15)g，雌雄不拘，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供，动物合格证号(SYXK2002-032)。牛磺酸(taurine)、毒胡萝卜素(thapsin)、环孢素 A(cyclosporin A，CsA)、抗葡萄糖调节蛋白 78(glucose-regulated protein 78，GRP78)抗体和抗CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)抗体均购自 Sigma，DMEM/F12培养基购自HyClone，胎牛血清为PAA产品，电泳相关试剂购自Promega，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠Ⅱ抗和SuperSignal发光增强试剂盒为Pierce产品。其它试剂均为国产分析纯。

2 动物模型及分组

SD大鼠45只分为正常对照组、CLP 1 h、CLP 2 h、CLP 4 h 、CLP 6 h、CLP 8 h和 CLP 6 h+牛磺酸 7组，CLP 1 h、CLP 2 h和CLP 4 h 3组每组3只，用于检测GRP78和CHOP表达，其余4组每组9只，其中3只用于检测GRP78和CHOP表达，6只用来检测血管反应性。实验前12 h禁食，自由饮水，实验当天用戊巴比妥钠(30～50 mg/kg，ip)麻醉，沿腹中线纵向切开腹腔，暴露并结扎盲肠，用三菱锥刺入盲肠末端造瘘，缝合关闭腹腔，右侧股动脉插管并经三通管连接水银血压计，经插管注射肝素钠生理盐水(500 U/kg)抗凝，观察血压，平均动脉压降至基础水平的70%以下可界定为脓毒性休克。各组在到达相应时点后处死大鼠，取肠系膜上动脉(superior mesenteric artery，SMA)，清除周围结缔组织，用于血管反应性和GRP78及CHOP表达测定。正常组大鼠插管，不造瘘。

3 离体血管环孵育及分组

SD大鼠24只分为对照组、毒胡萝卜素孵育组、毒胡萝卜素+牛磺酸组和毒胡萝卜素+CsA组，每组6只。戊巴比妥钠麻醉后，消毒腹部皮肤，处死大鼠，取出肠系膜上动脉，无菌PBS液清洗并清除周围结缔组织，制作成2～3 mm长的血管环。将血管环放入有完全培养基的24孔板内，加入各处理药物，在培养箱中孵育24 h:毒胡萝卜素8 μmol/L，牛磺酸20 mmol/L，CsA 0.2 μmol/L。

4 血管反应性测定

将肠系膜上动脉制成2～3 mm血管环，挂于注有K-H液的离体器官灌流槽中，持续冲入95%O2和5%CO2混合气体，给予初张力0.5 g，37℃恒温孵育2 h，每20 min换液1次，待张力曲线平稳后，测定血管环对去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)的反应性。血管环的血管反应性用NE浓度累积法测定，使所用 NE 终浓度分别为 1 ×10－9、1 ×10－8、1 ×10－7、1×10－6和1×10－5mol/L，记录不同 NE 浓度下血管环产生的最大收缩反应(Emax)，以收缩力/血管环质量(g/mg)为量化标准，做量－效曲线，用NE的Emax和量－效曲线评价血管的反应性。

5 Western blotting检测GRP78和CHOP

将血管组织置于预冷的蛋白裂解液［pH 7.6(mmol/L):HEPES 50，NaCl 150，EDTA 1，NP-40 1%，β-glycerophosphate 20，Na3VO41，NaF 1，benzamidine 1，para-nitrophenyphosphate 5，DTT 1，protein kinase inhibitor colktail pit］于冰浴中剪碎组织并匀浆，将上清置冰浴中冻融1 h;上清经1 000×g离心10 min(4℃)，收集上清即为胞浆总蛋白。采用Bradford法进行蛋白定量。等量样品蛋白(每泳道120 μg)经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜，转移完毕后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加入抗GRP78(1∶1 000)或抗CHOP 抗体(1∶1 000)孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记II抗(1∶8 000)室温孵育1 h，将待测的硝酸纤维素膜置于SuperSignal发光增强试剂中反应2～3 min后，迅速用塑料膜包裹硝酸纤维素膜，与X-ray胶片一同放入暗盒中曝光2～5 min，再将胶片显影、定影，结合膜上所标记的蛋白marker位置，确定蛋白条带的相应分子量。将胶片置于图像分析仪中，对目标条带进行扫描及灰度分析。

6 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，各组数据采用SPSS 13.0软件系统处理，组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。作图软件为Origin 5.0。

结 果

1 脓毒性休克后不同时点大鼠肠系膜上动脉GRP78和CHOP的表达变化及血管反应性变化

CLP后不同时点 SMA内质网应激标志分子GRP78和CHOP表达呈逐渐增高趋势，并于CLP后6 h达到高峰，用牛磺酸处理后GRP78和CHOP表达显著下降，见图1。CLP脓毒性休克后血管反应性显著下降，SMA对NE的量－效曲线明显右移，Emax显著下降(P＜0.01)，用牛磺酸处理后SMA对NE的量－效曲线明显左移，反应性得到显著恢复，Emax显著上升(P＜0.05)，见图2。上述结果提示脓毒性休克后血管存在内质网应激，内质网应激与休克后的血管低反应性密切相关。

Figure 1.The changes of protein expression of GRP78 and CHOP in SMA from CLP septic shock rats and the effect of taurine(Tau).C:control.图1 CLP脓毒性休克大鼠肠系膜上动脉GRP78和CHOP表达变化及牛磺酸对其的影响

2 毒胡萝卜素孵育后大鼠SMA对NE的反应性变化

经毒胡萝卜素孵育24 h后，大鼠SMA的反应性显著降低，对NE的量－效曲线明显右移，Emax显著下降(P＜0.01)，用牛磺酸处理后SMA对NE的量－效曲线明显左移，Emax显著上升(P＜0.05)，反应性得到显著恢复，见图3。这提示内质网应激能够诱导血管反应性降低。

3 CsA孵育后大鼠SMA对NE的反应性变化

经毒胡萝卜素孵育后，大鼠SMA的反应性显著降低，对NE的量－效曲线明显右移，Emax显著下降(P＜0.01);用CsA共同孵育24 h后，大鼠SMA的反应性显著升高，对NE的量－效曲线明显左移，Emax显著上升(P＜0.01)，见图4。这提示毒胡萝卜素诱导的内质网应激引起的血管反应性降低与MPTP开放有关。

Figure 4.The changes of the reactivity of SMA to NE after co-inbubation with cyclosporin A(CsA)and thapsin.Mean ± SD.n=8.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs thapsin.图4 CsA孵育后大鼠SMA对NE的反应性变化

讨 论

脓毒性休克、创伤失血性休克等临床重症存在血管低反应性，即血管对血管活性药物的反应降低或不反应。这种血管低反应性是导致严重创伤、休克晚期血压降低，病人难以治疗的重要原因之一。基于肌肉收缩效率取决于力/钙比率(force/Ca2+ratio)，前期本实验室提出并证实了“休克后血管平滑肌细胞肌肉收缩蛋白可能存在钙失敏，钙失敏在休克后血管低反应性的发生中起重要作用”的钙失敏机制［5］，并发现PKG、PKC和Rho激酶参与休克后血管平滑肌细胞钙敏感性的调控。针对钙失敏机制，本实验室发现小剂量的精氨酸加压素［6］(arginine vasopressin，AVP;0.4 U/kg)具有一定的血管反应性恢复作用，但仍不能完全恢复至正常水平;此外，针对休克血管低反应性发生的受体失敏和膜超极化机制的治疗措施也不能完全恢复血管反应性，这提示可能还有其它调控因素参与休克后血管低反应性的发生。基础研究显示内质网应激是由缺血缺氧、氧化应激、营养物质缺乏等病理生理刺激导致错误折叠或未折叠蛋白质在内质网腔内大量积聚的亚细胞应激。适度的内质网应激能使细胞发生未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，从而调整和保护自己，包括暂停蛋白质的翻译、上调内质网伴侣分子GRP78的表达等。当过强或持续的应激不缓解时则可诱导细胞凋亡，具体途径包括上调内质网应激另一标志性分子CHOP的表达、诱导MPTP开放等。MPTP开放介导线粒体途径的凋亡是内质网应激反应性凋亡的重要部分，并且参与多种疾病的发生。由此我们推测内质网应激可能通过MPTP诱导血管反应性降低。

本研究采用CLP脓毒性休克模型，观察了CLP后不同时点GRP78和CHOP的表达变化，同时观察了肠系膜上动脉血管反应性的变化。结果发现，CLP后随着时间的延长，血管平滑肌细胞内质网应激标志分子GRP78和CHOP的表达增加，呈逐渐增高趋势。而用内质网应激抑制剂牛磺酸处理后，GRP78和CHOP表达显著下降。CLP脓毒性休克后血管反应性显著下降，牛磺酸处理后血管反应性得到显著恢复。结果提示内质网应激与休克后的血管低反应性密切相关。进一步采用离体血管环与内质网应激诱导剂毒胡萝卜素孵育观察其对血管反应性的影响及牛磺酸和CsA的作用。结果表明，毒胡萝卜素能够显著降低离体血管环的血管反应性，牛磺酸能够显著恢复血管反应性，CsA也能够显著恢复血管反应性。上述结果提示，感染脓毒性休克可诱导内质网应激，后者通过诱导MPTP开放，导致血管的反应性降低。

目前普遍认为毒胡萝卜素是体外诱导内质网应激的工具药，其机制是通过抑制内质网的钙转运引起内质网钙稳态失衡所致［6］。毒胡萝卜素诱导血管低反应性是否是由于影响血管平滑肌细胞内钙离子浓度所致，我们没有直接测定胞内钙离子浓度变化，但我们的实验结果基本可以排除毒胡萝卜素导致血管反应性下降是因胞内钙离子浓度变化直接所致。因为毒胡萝卜素处理后细胞浆内的钙浓度应该是升高的，按理经毒胡萝卜素处理后血管反应性应该增高，而本实验结果却显示经毒胡萝卜素处理后血管反应性是降低的，说明毒胡萝卜素诱导血管反应性降低非细胞内钙离子浓度直接引起。确切关系需以后同步观察胞内钙离子浓度变化与血管反应性的关系来确定。本实验所用毒胡萝卜素的剂量和作用时间，均参考相关文献能诱导内质网应激的剂量和作用时间［7］。CsA 是公认的 MPTP 的抑制剂［8-9］。以往的研究显示MPTP开放主要参与细胞的凋亡调控，有研究显示MPTP介导的线粒体凋亡途径参与了休克后血管高渗透性的发生［10］。本研究结果初步显示MPTP参与了休克后血管低反应性发生。MPTP介导的线粒体凋亡途径是否参与这一过程尚需深入研究。作为机体的内源性物质，牛磺酸具有渗透压调控、钙平衡调节、维持细胞膜稳定和抗氧化等作用，多个研究显示牛磺酸能够通过调节钙稳态、抗氧化等作用抑制内质网应激，本实验检测的内质网应激标志分子结果也证实牛磺酸能够抑制内质网应激。但牛磺酸发挥血管功能保护作用的确切机制尚需下步深入研究。

［1］ 刘良明.严重创伤休克后血管反应性研究概况［J］.创伤外科杂志，2008，10(3):197-199.

［2］ Malhotra JD，Kaufman RJ.ER stress and its functional link to mitochondria:role in cell survival and death［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2011，3(9):a004424.

［3］ 刘 颖，纪 超，吴伟康.附子多糖保护缺氧/复氧乳鼠心肌细胞及其抗内质网应激的机制研究［J］.中国病理生理杂志，2012，28(3):459-463.

［4］ 岳 雯，姚树桐，鲍 颖.槲皮素对毒胡萝卜素诱导的巨噬细胞内质网应激凋亡途径的抑制作用及机制［J］.中国病理生理杂志，2012，28(3):518-523.

［5］ Xu J，Liu L.The role of calcium desensitization in vascular hyporeactivity and its regulation after hemorrhagic shock in the rat［J］.Shock，2005，23(6):576-581.

［6］ Fang YQ，Li T，Liu LM，et al.Beneficial effects of activation of PKC on hemorrhagic shock in rats［J］.J Trauma，2010，68(4):865-873.

［7］ 冯献启，游 泳，邹 萍，等.毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡及其机制的实验研究［J］.中国实验血液学杂志，2006，14(1):25-30.

［8］ Halestrap AP.What is the mitochondrial permeability transition pore?［J］.J Mol Cell Cardiol，2009，46(6):821-831.

［9］ Halestrap AP，Connem CP，Griffiths EJ，et al.Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischemia/reperfusion injury［J］.Mol Cell Biochem，1997，174(1):167-172.

［10］ Mendes CC，Gomes DA，Thompson M，et al.The typeⅢ inositol 1，4，5-trisphosphate receptor preferentially transmits apoptotic Ca2+signals into mitochondria［J］.J Biol Chem，2005，280(49):40892-40900.