SNS-032诱导弥漫性大B淋巴瘤OCI-LY-19细胞株凋亡及其作用机制的研究*

师宪平， 蓝晓莹， 温创宇， 陈 鑫， 刘焕亮， 黄美近

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)是目前发病率增长最快的恶性肿瘤，其中弥漫性大B淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常见的NHL。DLBCL是大B型淋巴细胞弥漫性恶性增生性疾病，在最近的10～20年间发病率逐渐增加。DLBCL在西方国家占成人非霍奇金淋巴瘤30%～40%，在发展中国家高达60%。按照肿瘤细胞来源和临床表现DLBCL分为生发中心B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤(germinal center B cell-like diffuse large B-cell lymphoma，GCB-DLBCL)、活化性B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤(activated B celllike diffuse large B-cell lymphoma，ABC-DLBCL)和原发性纵膈B细胞淋巴瘤(primary mediastinal B-cell lymphoma，PMBL)3型。迄今，利妥昔单抗联合CHOP方案(rituximab plus CHOP，R-CHOP;利妥昔单抗联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)被国际上公认为治疗侵袭性NHL的经典疗法，在治疗低度恶性NHL特别是GCB型DLBCL取得了良好的效果。然而在用药过程中产生了极大的耐药复发问题及并发症(支气管痉挛、心律失常、肝功能衰竭、呼吸困难等)，严重影响了治疗效果［1］，迫切需要筛选出作用机制各异的有效化合物治疗DLBCL。

SNS-032(BMS-387032)是一种新型的氨噻唑化合物，因其对细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclindependent kinase，CDK)的活性具有抑制作用，最初被定义为 CDK2、7、9 的抑制剂［2］。已有报道证明SNS-032可用于多种肿瘤，如急性粒细胞性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)［3］、慢性淋巴性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)［4］、多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)、结肠癌、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)等［5-6］的治疗，目前该化合物已处于CLL、MM及其转移性难治性实体瘤的I期临床试验阶段。本研究以GCB-DLBCL细胞株OCI-LY-19为研究对象，观察SNS-032对OCI-LY-19细胞的抗肿瘤活性，并分析其可能的作用机制，以期探讨该化合物在弥漫性大B淋巴瘤治疗中的潜在应用价值。

材料和方法

1 材料

OCI-LY-19细胞株购自中国医学科学院血液学研究所。胎牛血清购自HyClone。RPMI-1640培养基购自Gibco。MTS购自Promega。碘化丙啶(propidium iodide，PI)和Annexin V细胞凋亡检测试剂盒购自Sigma-Aldrich。抗聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase，PRAP］、含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3、9前体(procaspase-3和procaspase-9)、含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3、9切割体(cleaved caspase-3和 cleaved caspase-9)、蛋白丝/苏氨酸激酶 (protein serine/threonine kinase，Akt)、p-Akt、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)和 p-ERK抗体为 Cell Signaling产品。抗髓样细胞白血病1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)、X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)、信号转导子及转录激活子5(signal transductor and activator of transcription 5，STAT5)和p-STAT5抗体购自Upstate Technology。HRP－抗鼠/兔 Ig抗体为Pierce Biotechnology产品。

2 主要方法

2.1 细胞培养与加药 OCI-LY-19细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(含1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素)，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，实验所用的细胞均处于对数生长期。实验所用的SNS-032由DMSO溶解，贮存浓度为20 mmol/L。加药时用灭菌的PBS将SNS-032稀释至一定浓度，计算加药的体积，确保每组中DMSO的量一致(DMSO的终浓度控制在0.1%以下)。实验设计中所有的对照组(control，C)均加入与加药组等比例的DMSO和PBS混合液。

2.2 细胞活力检测实验 用MTS法测细胞活力抑制情况，取生长良好的OCI-LY-19细胞，配成单细胞悬液，稀释为2×108cells/L后，加至96孔板，对照组加入RPMI-1640培养基50 μL;实验组每孔加入含SNS-032的培养基50 μL，使 SNS-032终浓度为0、0.08、0.16、0.31、0.63 和 1.25 μmol/L，每组 3 个重复孔。加入不同浓度SNS-032作用68 h后于实验各孔分别加MTS试剂20 μL，37℃继续孵育4 h，酶联免疫检测仪测定各孔的吸光度值(测定波长490 nm)，以浓度为横坐标，细胞活力为纵坐标绘制SNS-032对OCI-LY-19细胞生长活力抑制的柱状图，用GraphPad Prism 4.0软件计算半数抑制浓度(50%inhibitory concentration，IC50)。

2.3 PI单染细胞形态学检测 OCI-LY-19细胞经0.5 μmol/L SNS-032 处理，5 h 后加入已过滤的 PI(1∶100)染液，多时点动态观察，显微镜TRITC荧光通道拍照记录PI阳性细胞(红染细胞)。

2.4 Annexin V/PI双标记法流式细胞术测定细胞凋亡 实验按照Sigma-Aldrich公司提供的试剂说明书操作，重复3次，实验设有不同药物浓度组。收集细胞，1×binding buffer洗涤细胞后，Annexin V工作液100 μL室温孵育 15 min，检测前每管加 PI 1 μL上机。该法能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。在双变量流式细胞仪的散点图上，取右下象限和右上象限的总和(即Annexin V阳性细胞群)计为凋亡细胞。

2.5 Western blotting检测 细胞密度调整至2×108cells/L，不同时点和不同浓度的SNS-032处理后收集细胞，加入蛋白裂解液RIPA(含蛋白酶抑制剂)充分裂解细胞提取蛋白，Bio-Rad蛋白浓度试剂盒紫外分光750 nm波长定量蛋白浓度。100～130 V恒压电泳约90 min，100 V恒压转膜约90 min，5%牛奶室温封闭1 h，I抗4℃过夜次日曝光。

3 统计学处理

用GraphPad Prism 4.0软件对数据进行分析，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，用单因素方差分析检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SNS-032抑制OCI-LY-19细胞活力

用不同浓度的SNS-032处理OCI-LY-19细胞72 h后发现，当药物浓度达到0.31 μmol/L时，药物对细胞的生长活力出现了明显的抑制(P＜0.05)。随着药物浓度增加，SNS-032对细胞活力的抑制就更加明显，见图1。经计算，SNS-032对OCI-LY-19细胞的IC50是 0.358 μmol/L。

Figure 1.Effect of SNS-032 on cell viability of DLBCL cell line OCI-LY-19.Mean ± SD.n=3.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(0 μmol/L).图1 SNS-032对弥漫性大B淋巴瘤细胞株OCI-LY-19活力的影响

2 SNS-032诱导OCI-LY-19细胞凋亡

0.5 μmol/L SNS-032 处理 OCI-LY-19 细胞后取6、12、26和36 h细胞分别进行PI单染并在荧光显微镜下观察，如图2所示，发现12 h后PI染色阳性细胞(红染细胞)明显增多(P＜0.05)，说明SNS-032明显诱导了细胞死亡。图3结果显示，与空白组比较，0.25 μmol/L 组、0.5 μmol/L 组和 0.75 μmol/L组细胞凋亡比例(右下象限和右上象限的总和数)明显增加，分别是7%、32%和52%，差异有统计学意义(P＜0.05)，这更进一步说明了SNS-032能明显诱导OCI-LY-19细胞发生凋亡。

Figure 2.SNS-032(0.5 μmol/L)induced death of DLBCL cell line OCI-LY-19(PI staining，×100).图2 SNS-032(0.5 μmol/L)诱导弥漫性大B淋巴瘤细胞株OCI-LY-19死亡

3 SNS-032对凋亡相关蛋白表达的影响

PARP切割呈SNS-032剂量与时间依赖性，procaspase-3、procaspase-9、XIAP与 Mcl-1 的表达随药物浓度和处理时间的增加而减少，cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达明显增多，Bcl-2没有明显变化，见图4。这说明SNS-032能明显增加 caspase-3与caspase-9前体的降解，诱导OCI-LY-19细胞凋亡，并且诱导细胞凋亡的通路与抑制XIAP和Mcl-1表达密切相关。

Figure 4.Effects of SNS-032 on the expression of apoptosis-related proteins PARP，procaspase-3，procaspase-9，cleaved caspase-3，cleaved caspase-9，XIAP，Mcl-1 and Bcl-2 in DLBCL cell line OCI-LY-19.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control(0 μmol/L or 0 h).图4 SNS-032对弥漫性大B淋巴瘤细胞株OCI-LY-19凋亡相关蛋白PARP、procaspase-3、procasepase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、XIAP、Mcl-1和 Bcl-2表达的影响

4 SNS-032对增殖相关蛋白表达的抑制作用

SNS-032在OCI-LY-19细胞中呈浓度和时间依赖性地下调Akt和STAT5的总蛋白及其磷酸化蛋白表达，下调ERK的磷酸化水平，ERK总蛋白未见明显变化，见图5。

讨 论

DLBCL是成人恶性淋巴瘤中最常见的一型，在形态学和临床表现上都具有显著的异质性，且细胞多药耐药基因显著表达，传统化疗药物治疗后预后很差［1］，新型药物的研发迫在眉睫。为此，我们选取了弥漫性大B淋巴瘤细胞株OCI-LY-19为研究对象，观察小分子化合物SNS-032对其增殖与凋亡的影响。实验结果显示，SNS-032可通过切割PARP，下调XIAP和Mcl-1表达及激活caspase-3和caspase-9而诱导OCI-LY-19细胞凋亡，同时抑制了与细胞增殖相关的JAKs/STATs、MEK/ERK和PI3K-Akt信号转导通路的表达与活化。据我们所知，这是首次发现SNS-032可以有效杀伤弥漫性大B淋巴瘤OCILY-19细胞。

Figure 5.Effects of SNS-032 on the expression of proliferation-related proteins Akt，p-Akt，ERK，p-ERK，STAT5 and p-STAT5 in DLBCL cell line OCI-LY-19.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(0 μmol/L or 0 h).图5 SNS-032对弥漫性大B淋巴瘤细胞株OCI-LY-19增殖相关蛋白Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、STAT5和 p-STAT5表达的影响

已有报道证明小分子化合物SNS-032可用于多种肿瘤，如急性粒细胞性白血病［3］、慢性淋巴性白血病［4］、多发性骨髓瘤、肠癌、非小细胞肺癌等［5-6］的治疗。国内外未见有关SNS-032作用于弥漫性大B淋巴瘤的报道，我们的研究显示了SNS-032具有明显的抗DLBCL作用。

实验过程中我们观察到SNS-032对能明显抑制OCI-LY-19细胞生长并诱导OCI-LY-19细胞凋亡。首先，MTS法显示，随着药物浓度增加，SNS-032对细胞的生长抑制率明显增加;再者，加入0.5 μmol/L SNS-032后，PI染色细胞数目增多，提示死亡细胞增多，而Annexin V/PI双标记流式细胞术检测结果显示用不同浓度SNS-032处理细胞24 h后，随着药物浓度增加，凋亡细胞增多;目前认为细胞凋亡的主要机制为caspase级联反应，而caspase-9与 caspase-3在caspase级联反应中分别在起始与执行上处于核心地位，是细胞凋亡发生的关键步骤。Caspase-9与caspase-3的活化意味着细胞凋亡［7］，为此，我们用Western blotting检测了caspase-9与caspase-3前体procaspase-3与procaspase-9的表达情况，结果显示两者前体形式的表达均随SNS-032浓度和时间的增大而减少，而具有DNA损伤修复作用且为caspase-3的底物PARP［8］也呈剂量与时间依赖性的增高而被切割，这都显示了caspase级联通路的活化。文献报道，IAPs家族的XIAP、Bcl-2蛋白家族中的Mcl-1和Bcl-2在细胞中表达增多时，细胞抗凋亡功能增强［9-10］，从结果来看，虽然Bcl-2的表达没有明显变化，但XIAP和Mcl-1的表达均随剂量与时间依赖性地增大而减少，细胞抗凋亡功能减弱。以上研究结果表明，SNS-032能诱导弥漫性大B淋巴瘤OCI-LY-19细胞的凋亡，其机制可能是抑制该类抗凋亡相关蛋白的表达，同时活化了caspase级联反应。JAKs/STATs、MEK/ERK和PI3K-Akt信号转导通路与细胞的增殖、分化及凋亡关系密切，这些通路异常活化可导致细胞异常增殖和恶性转化［11-13］。为此，我们检测这些通路中的关键蛋白Akt、STAT5、ERK的磷酸化形式及总蛋白的表达情况。结果显示，该类蛋白的总体蛋白及磷酸化形式p-Akt、p-STAT5、p-ERK的表达随SNS-032浓度和处理时间的增加而抑制，并且Akt与STAT5总蛋白的表达明显下降，这提示SNS-032抑制 JAKs/STATs、MEK/ERK和 PI3K-Akt信号通路中关键蛋白的表达与活化，从而导致OCILY-19细胞增殖受到抑制。而这些通路是否与细胞凋亡相关基因的表达有关，并且通过什么样的方式联系，是我们今后需要进一步探讨的科学问题。SNS-032为 CDK2、7、9的抑制剂，其中 CDK7和CDK9与RNA聚合酶II的磷酸化密切相关，SNS-032是否参与和OCI-LY-19细胞凋亡相关的基因，如XIAP和Mcl-1的转录调控过程，也是我们进一步要研究的关键问题。

总之，SNS-032通过抑制细胞抗凋亡相关蛋白的表达，抑制JAKs/STATs、MEK/ERK和 MEK/ERK信号转导通路的表达与活化，从而明显抑制弥漫性大B淋巴瘤OCI-LY-19细胞生长，诱导细胞凋亡，为临床上弥漫性大B淋巴瘤的药物治疗提供了新的备选小分子化合物与新的思路。

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