红藻氨酸诱导PC12细胞凋亡及阿魏酸对神经元的保护作用*

陈 勤， 叶海燕， 陈逸青， 余嗣明

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，临床上主要表现为学习记忆障碍和认知能力的丧失。AD患者尸解发现，脑内神经细胞出现大量凋亡(apoptosis)，并伴有神经元胞外老年斑(senile plaque，SP)沉积和胞内神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)。现已知，AD神经元凋亡主要是由于β淀粉样蛋白(amyloid betaprotein，Aβ)、自由基、兴奋性氨基酸、神经毒素、Ca2+超载、炎症等有害因子的共同作用所致。近年来，兴奋性氨基酸(excitatory amino acids，EAAs)和老年痴呆发病以及学习记忆的密切关系已引起重视。许多证据表明EAA的神经毒性作用，尤其是异常升高的谷氨酸(glutamic acid，Glu)在AD的发生、发展过程中起着极为重要的作用。谷氨酸是人脑内含量最高的兴奋性氨基酸，正常情况下，谷氨酸参与多种生理功能，但过量的谷氨酸可引起神经细胞内Ca2+超载、氧化应激、线粒体功能障碍、细胞骨架崩解等而造成神经元的损伤［1-2］。红藻氨酸(kainic acid，KA)是Glu的类似物，可选择性作用于脑内的突触前KA受体，刺激Glu的释放并抑制其再摄取，造成神经细胞过度兴奋而凋亡［3］。阿魏酸(ferulic acid，FA)是当归、川芎等中药的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎和改善学习记忆等药理活性［4-6］，阿魏酸钠注射液是国家一类新药，临床上主要用于动脉粥样硬化、冠心病、脑血管病、肾小球疾病、肺动脉高压、糖尿病性血管病变、脉管炎、偏头痛和血管性头痛的治疗。但有关FA能否具有降低KA诱导PC12细胞的神经毒性和神经元的保护作用?尚未见报道。本文采用KA诱导PC12细胞凋亡来观察细胞的活力及相关凋亡基因bcl-2、bax和细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)表达的变化，旨在揭示阿魏酸抑制AD神经元凋亡的作用机制。

材料和方法

1 材料

1.1 药品、细胞株与试剂 KA、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、DMSO和多聚赖氨酸(70～150 kD)均购自Sigma;FA购自中国药品生物制品检定所;低分化型PC12细胞株购自中科院细胞库;DMEM/F12培养基、胎牛血清购自HyClone;Bcl-2、Bax和Cyt C多克隆抗体均购自Santa Cruz;山羊血清、DAB显色试剂盒和SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;annexin V-FITC凋亡试剂盒购自南京凯基生物有限公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为北京博奥森生物技术有限公司产品;化学发光试剂为天根生化科技(北京)有限公司产品。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器 2123-2型SHELLAB CO2培养箱(Sheldon);BX41荧光显微镜(带DP70摄像系统)(Olympus);450型酶标仪(Bio-Rad);EPIC XL-MCL型流式细胞仪(Beckman Coulter);24孔、96孔培养板(Corning)。5417型台式冷冻离心机(Eppendorf);DYCZ-24DN型、迷你双垂直电泳槽和DYCZ-40D型半干式转移电泳槽均为北京市六一仪器厂产品。

2 方法

2.1 细胞培养 PC12细胞株用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养基在玻璃培养瓶中培养，培养条件为37℃、5%CO2浓度和饱和湿度，待细胞长至80%丰度后用0.25%胰酶消化传代l次(约2～3 d)，倒置显微镜观察细胞生长状况，实验时取对数生长期细胞进行实验。进行MTT实验前，将细胞接种到96孔培养板用无血清培养基培养;流式细胞仪检测前，将细胞接种至6孔培养板用无血清培养基培养;免疫组化实验均用24孔培养板爬片法培养细胞，培养基为无血清培养基。

2.2 实验分组及药物干预 当培养的细胞处于对数生长时，将细胞分为5组:(1)正常对照组:不加任何处理因素，换上同体积新鲜的无血清DMEM/F12培养基;(2)KA模型组:在培养液中加入终浓度为50 μmol/L KA;(3)FA低、中、高剂量组:在培养液中，加入 50 μmol/L KA 和 25、50 和 100 μmol/L FA。细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养，培养24 h后进行各项指标检测。

2.3 MTT法检测细胞存活率 取对数生长期的PC12细胞，用0.125%胰蛋白酶消化后调节密度为1×108/L接种于96孔板中，每孔加入100 μL，无血清培养24 h，然后按照上述分组方法进行药物干预，每组设置6个复孔，24 h后，每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μL继续在CO2培养箱中孵育4 h，然后取出96孔培养板，弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床上振荡10 min，待紫色结晶完全溶解后用酶标仪在490 nm波长处检测各孔的吸光度(absorbance，A)。以只加培养液的孔为调零参照，细胞活力用百分比表达，视对照组的细胞活性为100%。结果计算:细胞存活率(%)=实验组A490/对照组A490×100%。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数生长期的PC12细胞，用0.125%胰蛋白酶消化后调节密度为1×108/L接种于96孔板中，每孔2 mL，无血清培养24 h按照上述分组方法进行药物干预，每组设置6个复孔，24 h后，用细胞凋亡检测试剂盒内的缓冲液300 μL重悬，加入5 μL annexin V-FITC 混匀后，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混匀室温避光反应10 min，最后在1 h内进行流式细胞仪上机检测细胞凋亡率。在流式细胞仪的散点图上，左下象限表示为活细胞(annexin V-/PI-)，右下象限表示为早期凋亡细胞(annexin V+/PI-)，右上象限表示为晚期凋亡细胞(annexin V+/PI+)，左上象限表示为坏死细胞(annexin V-/PI+)。

2.5 免疫细胞化学检测Bcl-2、Bax和Cyt C的表达将盖玻片置于24孔板中，分组与药物处理同上。培养24 h后，弃去培养液，每孔加入200 μL 4%多聚甲醛固定30 min，PBS浸洗3次，每次5 min;每片加3%H2O2甲醇溶液200 μL，室温 10 min，PBS 浸洗 3次，每次5 min;小心取出盖玻片晾干，随机抽样，分3批，备用。实验时在切片滴加5%山羊血清30 μL，37℃湿盒中孵育20 min封闭;吸去封闭液(勿洗);滴加配好的Ⅰ抗 Bcl-2或 Bax或 Cyt C应用液(1∶100)30 μL，4 ℃ 湿盒孵育过夜;PBS 洗 5 min ×3次;滴加生物素标记的羊抗兔 IgGⅡ抗(1∶60)30 μL，于37 ℃湿盒孵育1.5 h;PBS洗5 min×3次;每片滴加 SABC 30 μL，于37℃湿盒孵育30 min;PBS洗5 min×3次;DAB显色，苏木精复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后镜检与拍片。以PBS置换Ⅰ抗作为阴性对照，实验中每批细胞片做1张阴性对照。光镜以胞浆被染为棕黄色或棕红色的细胞记为阳性细胞，在高倍视野(×400)下每张细胞片随机选取4个非重叠视野对各组Bax、Bcl-2和Cyt C反应阳性的细胞进行计数，计算占所有细胞的百分率。

2.6 Western bloting检测Bcl-2、Bax和 Cyt C 的表达水平 提取各组PC12细胞中的蛋白样品，用BCA试剂盒进行蛋白定量。取适量样品，加入等体积的2×上样缓冲液混匀，在100℃沸水中煮5 min，各组取15 μg样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(5%浓缩胶、12%分离胶)电泳分离，先用100 V电泳待溴酚蓝至浓缩胶底后改用120 V电泳，当溴酚蓝距离分离胶底1 cm时停止电泳。分离的蛋白在250 mA条件下转膜150 min，将目的蛋白转移到NC膜上，用TBST洗膜，室温下用新配的5%脱脂奶粉封闭作用3 h，TBST洗膜后分别加入TBST稀释的Ⅰ抗［β-actin(1∶1 000)、Bax(1∶300)、Bcl-2(1∶500)和 Cyt C(1∶500)］4 ℃过夜;TBST洗涤3×20 min，加入TBST稀释的辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗涤2×20 min，用化学发光剂避光反应3 min，将NC膜在暗室中曝光。以β-actin作为内参照，统计各组蛋白与β-actin A值的比值。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示。应用SPSS17.0统计软件对各组数据进行统计学分析。采用单因素方差(One-way ANOVA)分析，组间两两比较采用最小显著性差异(LSD)法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 阿魏酸对KA诱导的PC12细胞存活率的影响

由表1可见，KA处理组存活率仅为44.38%，与正常对照组相比差异显著(P＜0.01)，而FA处理组(25、50 和 100 μmol/L)存活率依次为 60.29%、72.26%和81.65%，与KA处理组相比差异有统计学意义(均P＜0.01)，并随着剂量的增加，有明显的量效关系，提示FA对KA诱导的PC12细胞活力降低具有较好的保护作用。

2 阿魏酸对KA诱导的PC12细胞凋亡率的影响

由流式细胞术散点图可知，正常组细胞凋亡率为3.65%，KA处理后凋亡率显著上升(56.21%)，而采用FA处理细胞后，25、50和100 μmol/L组细胞凋亡率分别为 34.90%、25.34%和 13.27%，表明FA可以明显抑制KA诱导的细胞凋亡，而且这种抑制作用与FA的剂量呈明显的量效关系，见图1和表1。

3 阿魏酸对KA诱导的PC12细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax和Cyt C表达的影响

3.1 免疫细胞化学法 与正常对照组相比，KA模型组Bcl-2阳性细胞数较少，而Bax和Cyt C阳性细胞数量明显增多，Bcl-2/Bax比值下降;经FA干预后，3个剂量组细胞中Bcl-2阳性率明显增加，而Bax和Cyt C阳性率显著减少，且Bcl-2/Bax比值上升明显，见图2和表2。3.2 Western blotting 图3显示，与正常对照组相比，KA模型组 PC12细胞 Bcl-2表达下调 (P＜0.01)，而 Bax和 Cyt C表达显著升高 (均 P＜0.01)。经FA 处理后，25、50 和100 μmol/L FA 组细胞中Bcl-2表达量明显升高，而Bax和Cyt C表达量显著减少，与KA模型组比较，差异显著(P＜0.05或 P ＜0.01)。

表1 阿魏酸对KA诱导PC12细胞存活率和凋亡率的影响Table 1.Effects of FA on the viability and apoptotic rate of PC12 cells induced by KA(mean±SD.n=10)

Figure 1.Effect of FA on the apoptotic rate of PC12 cells induced by KA.A:normal control group;B:KA(50 μmol/L)group;C ～ E:KA(50 μmol/L)+FA(25，50 and 100 μmol/L)groups.图1 阿魏酸对KA诱导的PC12细胞凋亡率的影响

Figure 2.Effect of FA on the expression of Bax in PC12 cells induced by KA(immunocytochemical staining，×400).A:normal control group;B:KA(50 μmol/L)group;C ～ E:KA(50 μmol/L)+FA(25，50 and 100 μmol/L)groups.→:positive cells.图2 阿魏酸对KA诱导的PC12细胞Bax表达的影响

表2 阿魏酸对KA诱导PC12细胞Bcl-2、Bax和Cyt C表达的影响Table 2.Effects of FA on the expression of Bcl-2，Bax and Cyt C in PC12 cells induced by KA(mean±SD.n=10)

Figure 3.Effects of FA on the expression levels of Bcl-2，Bax and Cyt C in PC12 cells induced by KA.1:normal control group;2:KA(50 μmol/L)group;3 ～5:KA(50 μmol/L)+FA(25，50 and 100 μmol/L)groups.Mean ± SD.n=3.##P ＜ 0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.图3 阿魏酸对KA诱导的PC12细胞Bcl-2、Bax和Cyt C表达量的影响

讨 论

大量的动物实验与临床研究表明，AD患者脑内神经元凋亡速度与其学习记忆功能减退的病程有密切的关系。以往对其机制的研究主要集中在Aβ在脑内的异常沉积对神经元的毒性方面，但近年来随着分子生物学的发展，发现AD患者大脑海马区兴奋性氨基酸浓度的异常升高可诱发大量神经细胞凋亡，因此兴奋性氨基酸及其受体抑制剂已成为目前研究与开发新药的靶点。Glu是中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质，与突触发生、神经变性、神经毒性等诸多生理、病理过程密切相关。在正常情况下，Glu具有长时程增强、神经可塑性等特征，在神经元和胶质细胞的增殖、存活与凋亡、学习和记忆、突触发生、突触传递效率和信号转导等方面发挥重要作用，但Glu分泌过量反而能造成神经元中毒(又称为兴奋性毒素)而凋亡，与癫痫、老年性痴呆和帕金森氏病等的发生有关［7-10］，有研究表明，AD老年斑中的Aβ与Glu摄取与释放(自稳态)、NMDA受体结合等存在相互关系［11］。KA是一种兴奋性氨基酸，常用作中枢神经系统的化学损伤剂，它特异性作用于神经元突触末梢的非NMDA类KA受体，刺激突触前膜Glu的释放并抑制突触后膜Glu转运蛋白再摄取，使得脑内海马区神经细胞中Glu浓度持续维持在高水平，同时激活星形胶质细胞释放大量的自由基、细胞因子和炎症介质等有害物质和抑制其对Glu的回收，进一步加重神经元损伤，从而引起细胞凋亡［12-18］。所以 KA的神经兴奋毒性作用可能是KA本身和内源性谷氨酸递质共同作用的结果。本实验发现，在培养的PC12细胞中加入50 μmol/L KA作用24 h后，可见细胞存活率仅为44.38%，而细胞凋亡率上升到56.21%，与空白对照组相比差异显著(P＜0.01)，通过对凋亡基因蛋白进行免疫细胞化学检测显示，KA可抑制抗凋亡基因bcl-2的表达，而使促凋亡基因bax的表达升高，且降低Bcl-2/Bax比值，可见KA诱导神经细胞凋亡可能是通过Bcl-2家族而介导的。

Cyt C是线粒体呼吸链中的一个基本成分，除了参与电子传递外，也可作为凋亡起始因子在细胞凋亡中发挥重要作用。我们发现KA作用PC12细胞24 h后，即可使细胞内Cyt C的表达量升高，与正常对照组比较差异极显著。当采用阿魏酸(25、50和100 μmol/L)干预处理后，PC12细胞的存活率明显升高，细胞凋亡率随之下降，胞内的Bcl-2表达升高，Bax表达下降，于此同时Cyt C表达也随之下降。由此我们认为，KA诱导神经细胞凋亡的机制可能是下调抗凋亡基因蛋白Bcl-2，上调促凋亡基因蛋白Bax的表达，后者在线粒体上易位，最终导致Cyt C从线粒体膜间隙渗漏到细胞质内［19］，与凋亡蛋白酶激活因子 1(apoptotic protease-activating factor 1，Apaf-1)结合，进而激活caspase-9和caspase-3启动凋亡级联反应。阿魏酸抗细胞凋亡的作用机制可能是通过上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白的表达，提高 Bcl-2/Bax的比值，抑制Bax二聚体的形成，防止Cyt C外漏，保护线粒体结构，从而抑制神经元的凋亡。

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