大肠埃希菌多重耐药外排泵AcrAB-TolC主动外排机制的研究

朱莉丽，刘德梦

（天津医科大学第二医院感染性疾病研究所，天津 300211）

大肠埃希菌的主动外排作用是细菌产生多重耐药的重要途径[1]。有研究显示AcrAB-TolC 外排泵是大肠埃希菌占绝对优势的多重药物外排泵[2]，底物广泛，包括抗生素等化学物质。其外排过程需质子驱动力介导，羰基氰氯苯腙（CCCP）属于质子泵抑制剂，通过抑制膜的电化学质子梯度，使通道蛋白失活，从而抑制细菌对药物的泵出[3]。为了解大肠埃希菌主动外排泵AcrAB-TolC 的存在情况，在多重耐药中所起作用，本研究对大肠埃希菌临床株进行体外药敏试验，并对膜融合蛋白（acra）及外排转运蛋白（acrb）编码基因进行扩增，采用质子泵抑制剂CCCP 抑制外排泵的活性，观察CCCP 处理前后大肠埃希菌最低抑菌浓度变化。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 90 株大肠埃希菌分离自2008年7月-2009年7月天津市某三甲医院患者送检标本，剔除同一病例相同部位重复菌株。所有菌株经常规生化鉴定。大肠埃希菌ATCC25922 作为质量控制菌株，金黄色葡萄球菌ATCC25923为acra/acrb 基因阴性对照菌株。

1.2 体外药物敏感实验与CCCP 抑制试验 氨曲南、头孢噻肟、左氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星药敏纸片均购自天津滨海华康医疗器械贸易有限公司；头孢曲松、头孢噻肟、左氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素标准品购自中国药品生物制品检定所；泵抑制剂CCCP 购自Sigma 公司。采用K-B纸片法测定90 株大肠埃希菌临床株对6 种抗菌药物敏感性，药敏结果依据美国临床实验室标准化研究所（CLSI2011）判定标准。根据耐药模式分为多重耐药组、双药耐药组、单药耐药组、全敏感组。选取10 株多重耐药菌株进行CCCP 抑制试验，采取微量肉汤稀释法测定加泵抑制剂CCCP（终浓度为100μmol/L）[4]前后多重耐药菌株对5 种抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。

1.3 DNA 提取 采用煮沸法提取细菌基因组DNA。98℃水浴加热10 min，以12 000 r/min 离心6 min，吸取上清液保存，作为聚合酶链反应（PCR）模板。用紫外分光光度计测A260 和A280 值，计算核酸纯度和浓度。

1.4 外排泵基因acra、acrb 的PCR 扩增 采用煮沸法提取的基因组DNA，分别使用两对引物进行扩增，acra 引物序列F:CCTCAAGTTAGCGGGATTAT；R:ACCGTCCTGCGGGAACTTAA；acrb 引 物 序列F:GTGGGTGATGTTCGGTTG；R:CGTTTTAACCACTTC GTGA。扩增片段长度分别为567 bp，516 bp。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，DNA 聚合酶系统购自TAKARA 公司。PCR 反应总体积为25μL（DNA 聚合酶系统Premix Taq12.5μL，上游引物及下游引物各1μL，DNA 模板2μL，去离子水8.5μL）；基因扩增反应条件：94℃预变性4 min，95℃变性30 s，退火温度acra 基因58℃（acrb 基因55℃）30 s，72℃延伸acra 基因30 s(acrb 基因40 s)，共30个循环，然后72℃终末延伸4 min。

1.5 电泳及测序 在含0.5 mg/L 的溴化乙啶的1%琼脂糖凝胶中电泳30 min，使用BIO-RAD 凝胶成像系统观察结果，分析PCR 产物。PCR 产物送北京华大科技有限公司进行正负双向DNA 序列分析。

1.6 统计方法 以SPSS17.0 统计软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验，P<0.05 具有统计学意义。

2 结果

2.1 体外药物敏感实验结果 90 株大肠埃希菌对6 种抗菌药物均表现出不同程度的耐药，耐药率由高到低为环丙沙星67%，左氧氟沙星61%，庆大霉素53%，头孢噻肟50%，氨曲南20%，阿米卡星10%。耐药模式以双药耐药30 株（33.3%），多重耐药26 株（28.9%）为主，单药22 株（24.4%），全敏感12 株（13.3%）。

2.2 acra、acrb 基因的PCR 扩增结果 外排泵基因acra/acrb 以1.4 处引物序列，进行PCR 扩增。在90株大肠埃希菌中55 株（61.1%）大肠埃希菌临床株均可见567 bp（acra）及516 bp（acrb）的扩增片段。金黄色葡萄球菌ATCC25923 未见此扩增片段（图1，2）。外排泵基因acra、acrb 在4 种耐药模式的大肠埃希菌临床株中普遍存在，在多重耐药模式中阳性率分别高达84.6%和80.8%，见表1。

表1 各类菌株中acra/acrb 基因阳性率（%）Tab 1 The positive rates of acra/acrb gene in various strains（%）

对多重耐药组及全敏感组进行统计学分析，采用χ2检验，acra 基因P=0.017，acrb 基因P=0.009，结果具有显著统计学意义。

2.3 基因测序结果 选取大肠埃希菌临床株246 acra 基因扩增产物及临床株b716 acrb 基因扩增产物进行正负双向DNA 序列分析，测序结果在Gen－Bank 数据库中进行同源性比对后证实：临床株246，acra 同源性为98%,临床株b716，acrb 同源性为99%。

2.4 CCCP 抑制试验结果 10 株多重耐药的大肠埃希菌临床株在应用CCCP 后，多数菌株对5 种抗生素的MIC 均有不同程度的下降，能使绝大多数菌株恢复对抗生素的敏感性，见表2。菌株1034 对头孢曲松的MIC 最高下降倍数达128 倍，A620、C636、1034 这3 株菌株对5 种抗生素均由耐药变为敏感。

表2 加入CCCP 前后10 株多重耐药大肠埃希菌MIC 的改变Tab 2 MICs of 10 Escherichia coli isolates with and without CCCP

3 讨论

在抗生素的选择压力下,细菌几乎对所有临床使用的抗生素都可能产生耐药性。本研究所试90株大肠埃希菌对6 种抗生素均表现出不同程度的耐药，环丙沙星耐药率最高为67%，其次为左氧氟沙星61%，阿米卡星最低为10%。上述结果与2009年中国CHINET 细菌耐药性监测结果基本相近[5]。究其原因，与氟喹诺酮类抗菌药物的大量应用有关，而使用较少的阿米卡星、氨曲南则对大肠埃希菌的抑制作用相对较强。从耐药模式分布来看，双药耐药、多重耐药菌占绝大多数。

研究显示细菌的主动外排机制被认为是细菌产生多重耐药的主要机制，染色体DNA 上的acrAB基因编码的AcrAB-TolC 外排泵是大肠埃希菌最主要的主动外排系统，可完成对抗生素、化学治疗剂等多种药物及胆盐、染料、去污剂等的外排[6]，对细菌适应外界环境具有重要的意义。如果该系统失活，则菌株即从多重耐药状态变为敏感状态。该外排泵的构成主要由膜融合蛋白（AcrA）、外排转运蛋白（AcrB）和外膜通道蛋白（TolC）3 部分组成，以三聚体的形式穿越细菌内膜和外膜，使之形成一个密封的通道，将物质由胞内运输到胞外[7]。由于TolC 是多种外排泵外膜的共同通道，对于AcrAB-TolC 外排泵不具有特异性，因此本研究仅检测acra/acrb 基因在大肠埃希菌临床株中的携带情况。本试验结果显示，acra/acrb 在多重耐药组阳性率最高，分别为84.6%和80.8%，明显高于其它3组，且多重耐药组acra/acrb 基因阳性率与全敏感组进行统计学比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。提示acra/acrb 基因编码的外排泵可能是大肠埃希菌多重耐药重要的原因之一。值得注意的是，敏感组的大肠埃希菌也有携带acra/acrb 基因的菌株，考虑这些菌株中acra/acrb 基因没有表达，或处于失活状态。

AcrAB-TolC 外排泵属RND 家族，以质子驱动力为能源。CCCP 是一种抑制质子转运的解耦联剂，通过抑制主动外排能量来源的质子浓度梯度，使主动外排系统失去活性，恢复细菌对药物的敏感性[8]。CCCP 抑制试验结果显示，应用CCCP 后绝大多数多重耐药大肠埃希菌对多种抗生素的MIC 比CCCP应用前均有下降，最高下降倍数达128 倍，多数菌株对抗生素由耐药变为敏感。由此可见，在大部分大肠埃希菌临床分离株中存在对抗菌药物的主动外排作用，CCCP 能有效抑制细菌对抗菌药物的主动外排作用。MIC 下降倍数不等，说明外排泵主动外排作用大小并不相同，或者其主动外排机制可能与其它机制一同导致大肠杆菌抗菌药物多重耐药。

国内外研究表明，外排泵抑制剂与抗菌药物联合应用可以逆转细菌的耐药性，这为解决细菌的耐药性问题提供了新思路。目前已经发现多种具有不同作用机制的外排泵抑制剂，但是许多在体外活性良好的外排泵抑制剂由于安全性、特异性、机制明确性等诸多问题未能用于临床治疗。因此,寻找有应用前景的外排泵抑制剂对于细菌性感染的治疗有着深远的意义。

［1］Higgins C F.Multiple molecular mechanisms for multidrug resistance transporters[J].Nature,2007,446（7137）:749

［2］Blair J M,Piddock L J.Stucture,function and inhibition of RND efflux pumps in Gram-negative bacteria:an update[J].Curr Opin Microbiol,2009,12（5）:512

［3］Schumacher A,Trittler R,Bohnert J A,et al.Intracellular accumulation of linezolid in Escherichia coli,Citrobacter freundii and Enterobacter aerogenes:role of enhanced efflex pump activity and inactivation[J].J Antimicrob Chemother,2007,59（6）:1261

［4］张海旺，邓旭明，任晓慧.主动外排系统介导的大肠杆菌多重耐药性的确证[J].中国兽医学报，2005,25（2）:173

［5］卓超，苏丹虹，倪语星,等.2009年中国CHINET 大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志，2010,10（5）:325

［6］Paixao L,Rodrigues L,Couto I,et al.Fluorometric determination of ethidium bromide efflux kinetics in Escherichia coli[J].J Biol Eng,2009,3:18

［7］Nagano K,Nikaido H.Kinetic behavior of the major multidurg efflux pump AcrB of Escherichia coli[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106（14）:5854

［8］Zhang Z,Liu Z Q,Zheng P Y,et al.Influence of efflux pump inhibitors on the multidurg resistance of Helicobactor pylori [J].World J Gastroenterol,2010,16（10）:1279