IL-17对黑色素瘤B16F10细胞增殖和侵袭的影响

王 倩 ，马跃美 ，孙 涛 ，刘艳荣 ，房东亮 ，田 原

（天津医科大学1.外科手术学教研室；2.病理学教研室，天津300070）

白细胞介素-17（IL-17）在炎症和自身免疫性疾病中具有重要的调节作用且在多种肿瘤中高表达，但其在肿瘤发生发展中的作用目前尚未定论。目前关于IL-17对肿瘤细胞体外增殖作用的影响研究较少。近年来研究证明IL-17可以上调MMPs、IL-6和IL-8等促侵袭因子的表达促进肿瘤侵袭[1-2]。黑色素瘤是一种高侵袭性的恶性肿瘤，肿瘤细胞本身可以分泌MMP-2和MMP-9等基质金属蛋白酶降解细胞外基质（ECM），促进肿瘤侵袭转移。本研究在前期研究慢性炎症与肿瘤关系的基础上，通过体外实验探讨了IL-17对黑色素瘤B16细胞增殖和侵袭的影响，为进一步研究IL-17在慢性炎症与肿瘤发生发展中的调节作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠黑色素瘤细胞株B16F10由天津医科大学病理学教研室冻存。重组鼠IL-17购自美国PeproTech公司，transwell小室（直径为 8μm）购自Invitrogen公司，MTT购自美国Sigma公司，Matrigel胶购自美国BD公司，细胞培养板购自美国Costar公司，胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 小鼠黑色素瘤细胞B16F10，接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中 (加入青霉素、链霉素各100 U/mL)，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化传代。所有实验均选用对数生长期的细胞。

1.2.2 MTT法检测B16细胞的增殖能力 将B16细胞制备成1×104/mL单细胞悬液，按每孔200μL接种于96孔培养板，培养24 h后在培养液中加入终浓度分别为 5、10、20、50、100 ng/mL 的 IL-17，并设空白对照组，在培养箱中分别放置24、48、72 h后，加入MTT 100μL培养4 h，吸弃液体，每孔加入100μLDMSO充分溶解15min。用酶标仪于490 nm处测吸光度值(A值)，以5复孔的平均A值为相应的A值。

1.2.3 transwell侵袭实验检测B16细胞的侵袭能力 用50mg/LMatrigel胶1∶8稀释液包被transwell小室的上室面，37℃孵育过夜。实验前细胞用无血清培养基培养过夜，次日消化重悬细胞，于下室加入含10%胎牛血清的培养基、上室中加入无血清和浓度为50 ng/mL IL-17的B16细胞悬液各200μL，并设空白对照组，在培养箱中培养48 h后取出小室，PBS淋洗，擦去上室中细胞，95%酒精固定10min，4 g/L结晶紫染色，PBS清洗，200倍倒置显微镜下拍照穿膜细胞，随机选10个视野，计算平均数。实验重复3次，每组各设3复孔。

1.2.4 明胶酶谱检测B16细胞MMP-2和MMP-9的表达活性 将无血清的B16细胞接种到24孔板，每孔500μL，培养24 h后，在培养液中加入50 ng/mL IL-17，培养48 h后，收集上清液，12 000 r/min，离心10min，取上清液进行明胶酶谱检测。以含0.1%明胶的10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳至溴酚兰进入阳极缓冲液为止，分离凝胶，2.5%Triton-X100洗胶4次，每次30min。将胶完全浸入明胶酶孵育液（50mmol/L pH7.5Tris-HCl、10mmol/LCaCl2、200mol/LNaCl、1 μmol/L ZnCl2）中，37 ℃孵育 42 h，常规考马斯亮蓝染色，脱色液脱色至复染带清晰，图像分析系统测定凝胶中MMPs活性条带活性水平，应用Gel-pro analyzer分析软件测定条带平均灰度值。

1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS17.0软件做统计分析，多组比较采用方差分析，两独立样本比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-17对B16细胞增殖能力的影响 不同浓度IL-17作用于B16细胞24、48和72 h时，实验组与对照组相比，细胞活力无变化，IL-17对细胞的增殖无影响，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.2 IL-17对B16细胞侵袭能力的影响 50 ng/mL IL-17作用于B16细胞48 h后，与对照组相比，穿膜细胞数明显增多，差异有统计学意义（P<0.01）（表2 和图 1）。

2.3 IL-17对B16细胞MMP-2和MMP-9表达活性的影响 明胶酶谱检测结果显示，50 ng/mL IL-17作用于B16细胞48 h后，可明显增强细胞MMP-2和MMP-9活性，差异有统计学意义（P<0.01）（表3和图 2）。

表1 IL-17作用不同时间B16细胞的A值(n=5)Tab1 Absorbanceof B16 cells treated with IL-17 on different time(n=5,)

表1 IL-17作用不同时间B16细胞的A值(n=5)Tab1 Absorbanceof B16 cells treated with IL-17 on different time(n=5,)

分组对照组5 ng/mL组10 ng/mL组20 ng/mL组50 ng/mL组100 ng/mL组FP 72 h 0.466±0.042 0.485±0.043 0.449±0.045 0.507±0.007 0.503±0.023 0.487±0.015 2.29 0.08 48 h 0.364±0.039 0.376±0.038 0.358±0.049 0.377±0.035 0.408±0.028 0.364±0.039 1.16 0.36 24 h 0.226±0.018 0.237±0.020 0.219±0.018 0.235±0.017 0.260±0.033 0.236±0.028 1.77 0.16

表2 IL-17对B16细胞侵袭能力的影响)Tab2 Effectof IL-17 on invision ability of B16 cells

表2 IL-17对B16细胞侵袭能力的影响)Tab2 Effectof IL-17 on invision ability of B16 cells

与对照组相比*P<0.01

n99组别对照组50 ng/mL组t穿膜细胞数8.89±1.45 34.22±1.56*35.61

表3 IL-17作用下B16细胞MMP-2和MMP-9的活性分析Tab3 AnalysisofMMP-2 and MMP-9 activitiesof B16 cells treated with IL-17

表3 IL-17作用下B16细胞MMP-2和MMP-9的活性分析Tab3 AnalysisofMMP-2 and MMP-9 activitiesof B16 cells treated with IL-17

与对照组相比*P<0.01，**P<0.001

MMP-9 5.26±0.29 28.28±1.51**26.00 MMP-2 7.06±0.62 13.64±2.32*4.75组别对照组实验组t

3 讨论

IL-17是一种主要由活化记忆CD4+T细胞即Th17细胞分泌的促炎因子。研究表明，Th17细胞及IL-17与炎症和自身免疫性疾病如风湿性关节炎、炎症性肠病、多发性硬化等多种疾病相关。目前IL-17对肿瘤的作用尚存在争论。有研究认为，IL-17通过T细胞依赖的机制产生抗肿瘤效应[3]。但多数研究倾向于IL-17的促肿瘤作用。IL-17通过激活IL-6依赖的Stat3信号通路促进肿瘤生长[4]；IL-17可促进人促绒癌JEG-3细胞的增殖和侵袭，但其机制尚未阐明[5]；结肠癌中，IL-17通过诱导癌细胞分泌VEGF促进肿瘤血管生成，且与患者预后呈负相关[6]。

本课题组在前期建立小鼠气囊卡介苗慢性炎症模型[7]的基础上成功构建了气囊卡介苗-黑色素瘤的慢性炎症-肿瘤复合模型，结果表明实验组肿瘤体积、重量、明胶酶表达活性、微血管密度（MVD）及VEGF 5项指标与生理盐水-黑色素瘤对照组相比均升高。进一步检测小鼠血清细胞因子发现，实验组与对照组相比，IL-17较其他细胞因子明显升高，笔者推测在此气囊卡介苗-黑色素瘤模型中IL-17可能对上述5项检测指标发挥重要的调节作用。为了进一步探讨IL-17是否对肿瘤生长有直接作用，笔者在体外用IL-17刺激B16细胞，结果显示IL-17并不直接刺激黑色素瘤细胞增殖，推测其可能通过诱导黑色素瘤细胞或基质细胞分泌VEGF进而促进血管生成来促进肿瘤生长。

本研究transwell侵袭实验结果显示，IL-17处理后B16细胞穿膜细胞数明显增多，提示IL-17可以促进B16细胞的体外侵袭。MMPs是一类与肿瘤侵袭相关的锌依赖性肽链内切酶家族，通过降解和重塑细胞外基质（ECM），破坏基底膜，促进肿瘤侵袭和转移，其生成和活化依赖多种细胞因子。近年来研究表明MMPs的表达与IL-17相关。在银屑病性关节炎中，IL-17可诱导IL-6、IL-8和MMP-3的产生，阻断IL-17RA抑制它们产生[8]；在垂体腺瘤中研究发现，浸润组肿瘤组织IL-17及IL-17R表达水平明显升高且与MMP-9表达呈正相关[9]；而且IL-17通过激活AKT依赖的IL-6/JAK2/STAT 3信号途径上调肝癌细胞IL-8、MMP-2、VEGF的表达，促进肝癌迁移、侵袭[2]。本研究显示，IL-17处理B16细胞后其MMP-2和MMP-9的活性增强，提示IL-17可能通过上调MMP-2和MMP-9的活性来促进B16细胞的侵袭能力，但其具体机制尚待进一步研究。

综上所述，IL-17对黑色素瘤B16细胞的增殖无明显的刺激作用，但可增强细胞的体外侵袭能力，可能通过增强MMP-2和MMP-9的活性而发挥作用，其具体机制目前尚不清楚。本研究为探讨IL-17在慢性炎症与肿瘤进展中的调节作用提供了实验依据，也为通过调控IL-17等炎症因子的方法抑制黑色素瘤的侵袭和转移提供了新思路。

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