TOX和SMAD3基因多态性与中国汉族人群2型糖尿病患者微血管病变的易感性相关

吕 佳，蔡春友，魏凤江，张 红，林静娜，韩鸿玲，陈莉明，李卫东

（1.天津医科大学基础医学研究中心，天津300070；2.天津医科大学眼科医院，天津300384；3.天津市人民医院，天津300121；4.天津医科大学总医院，天津300052；5.天津医科大学代谢病医院，天津300070）

糖尿病微血管病变（microvascular complications of diabetes,MVCD）主要包括糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）和糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR），是糖尿病最常见的并发症，其致死率和致盲率呈逐年上升的趋势。先前的研究证实，糖尿病病程的长短和血糖的控制情况是MVCD发病的危险因素[1-2]，然而，有些患者MVCD的发生与血糖控制的程度并不相关[3]。另外有大量的研究表明MVCD在不同种族中患病率具有明显的差异，而且其家族聚集现象也很明显，这些都提示遗传因素在MVCD的发生发展中起重要作用[4]。本研究以1 090名久居于天津地区的中国汉族2型糖尿病患者为研究对象，选取MVCD候选基因的SNP位点进行基因分型，旨在探讨在中国汉族人群2型糖尿病患者中MVCD的遗传背景和风险基因。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究共收集了1 090名天津地区的2型糖尿病患者，均为汉族，相互之间没有血缘关系，其中男性571人，女性519人，年龄在23～87岁之间，平均为（60.75±11.11）岁，患者均参照2010年美国糖尿病协会公布的糖尿病诊断标准确诊[5]。其中DN患者共615人（DN诊断标准为:有糖尿病史且微白蛋白/肌酐>300mg/g，除外原发肾小球病和其他继发肾小球疾病）。非DN糖尿病患者475人；非增殖性糖尿病视网膜病变患者（DR）共290人，增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）患者共87人，非DR糖尿病患者713人；同时罹患DN和DR的糖尿病患者共157人；糖尿病病程超过10年，非DN非DR患者共165人。糖尿病视网膜病变患者均经眼底镜或眼底照相检查，经天津医科大学眼科医院两名专家确诊。调查和取样均征得受试者本人同意并签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用高盐法（原平皓公司试剂盒）用来提取外周血白细胞基因组DNA，应用Nanodrop 2000/2000c分光光度计测定样品浓度及其在230 nm、260 nm及280 nm波长处的光密度（OD）值，记录样品浓度（μg/μL）和纯度后置于-80℃保存备用。

1.2.2 候选基因及SNP的选择 此次研究的候选基因一部分来自于2007年对2型糖尿病全基因组关联研究（genome-wide association study,GWAS）的结果[6-7]，以及先前本实验室对糖尿病、肥胖候选基因SNP位点基因分型（genotyping）的结果（李卫东等，待发表资料），另一部分来自于以往的相关报道和MVCD发生有关的生物学途径。依据SNP数据库（The Single Nucleotide Polymorphism Database，db-SNP）中每个基因SNP位点的连锁不平衡状态和中国汉族人群的等位基因频率，选择了与糖尿病微血管病变有关的14个基因的23个SNP位点，并对这些SNP位点进行基因分型（表1）。

1.2.3 基因分型 1 090例2型糖尿病患者基因分型由IlluminaSNP芯片技术平台进行。在进行基因分型时设重复对照，以便对基因分型结果进行监测和质量控制。基因分型的结果录入Filemaker Pro数据库中。

1.3 数据分析 数据分析应用PLINK软件对病例对照样品进行二分变量的关联分析，PLINK比较病例和对照组等位基因频率，进行Chi方检验。在对照组的选择上，我们采取两种方案：（1）采用某种疾病(DN,DR,PDR和MVCD)的所有非患病个体作为对照；（2）以2型糖尿病病程超过10年，非DN非DR者作为对照 （n=165）。因为此次进行基因分型的SNP位点较少，并且相同基因SNP位点间存在连锁不平衡，所以未对二分变量关联分析进行多重检验的调整。

表1 糖尿病微血管病变候选基因SNP位点选择Tab1 SNP selection ofMVCD candidategenes

2 结果

在1 090例糖尿病患者中，针对DN、DR、PDR和MVCD，对候选基因SNP位点进行了病例-对照的二分变量关联分析，结果见表2、表3。

以病程大于10年，无DN无DR糖尿病患者为对照，得到的关联更加显著：发现TOX基因的rs1526167位 点 与 DN（P=0.002，OR=0.60）、DR（P=0.011，OR=0.635）、PDR（P=0.044，OR=0.587）和MVCD（P=0.001，OR=0.596） 均存在显著关联，SMAD3基因的 rs12102171位点与 DN（P=0.042，OR=1.453）、DR（P=0.010，OR=1.656）、PDR（P=0.017，OR=1.947）和 MVCD（P=0.024，OR=1.507）均存在显著关联。而另一些基因（IGF2BP2、CDKAL1、ESR1）SNP位点则与DN或PDR有关联（表2）。

表2 候选基因SNP位点与糖尿病微血管病变的关联分析（P值）Tab2 Association analyses for candidategene SNPs and diabeticm icrovascular complications(P values)

表3 TOX和SMAD3基因SNP位点与糖尿病微血管病变的关联分析Tab3 Associationsam ong TOX,SMAD3 gene SNPsand diabeticm icrovascu lar comp lications

3 讨论

MVCD是糖尿病最常见的并发症，是导致慢性肾功能不全和非外伤性致盲的主要原因，严重危害着糖尿病患者的健康。由于MVCD在不同人种中的患病率差异和明显的家族聚集现象，人们对基因在MVCD发病中的作用日益重视。目前已有许多关于MVCD易感基因的研究报道，这些基因可以分为7类，分别是 VEGF[8]、EPO[9]、ACE[10]、IL1RN、PON1[11]、SOD2[12]和HFE，这些基因及其作用与糖尿病相关基因并不完全相同，表明MVCD遗传性可能独立于糖尿病自身的遗传性。

此次研究采用大样本、多基因的研究方法，探讨MVCD在2型糖尿病患者中的易感基因，以揭示MVCD的遗传背景。本实验共收集了1 090名2型糖尿病患者，按照MVCD患病情况进行分组（DN、DR、PDR、MVCD），采用病例对照的方法进行二分变量的关联分析。以往的MVCD遗传学研究，均以健康人群为对照，忽略了血糖、病程等因素对实验的影响。因此本次研究对照组选取165名病程大于10年非DR非DN的糖尿病患者，尽量避免上述因素对实验造成的影响。从结果可以看出，如果以病程大于10年非DR非DN的糖尿病患者作为对照，尽管对照组人数较少(n=165)，但SMAD3、TOX基因SNP位点与DN、DR、PDR、MVCD的关联更加显著，提示SMAD3、TOX基因是MVCD的易感基因，且MVCD的遗传背景与糖尿的遗传背景不同。应当指出，有些2型糖尿病患者虽未发现微血管病变，但其已具备发生MVCD的遗传学基础，只是病程较短尚未发病，以这部分人作为对照来寻找MVCD的易感基因显然值得商榷。我们采用病程>10年非DN非DR的T2D患者作为对照，可有效地检出与MVCD相关(而不是与T2D有关)的基因，诚然，本实验这部分对照的人数尚少，在一定程度上影响了检验效能（power）。

目前对MVCD发病机制的研究已经深入到了细胞因子信号转导通路的层面，其中TGF-β/Smad信号转导通路在MVCD发生和发展中的作用（特别是与器官纤维化的关系）已经得到了肯定[13]。SMAD3作为细胞膜受体和靶基因之间的关键桥梁，在TGF-β信号通路中发挥了核心作用，是TGF-β信号转导通路中不可或缺的重要介质[14]。SMAD3基因具有多个SNP位点，这次我们选取rs1498506和rs12102171两个位点。从本研究的PLINK结果中可以看出，SMAD3基因的 rs12102171与 DN、DR、PDR、MVCD均相关，与以往的研究结果相一致。

大量的研究表明，肥胖（尤其是内脏型肥胖）是产生胰岛素抵抗的重要因素，而胰岛素抵抗又是2型糖尿病发生的基础。在先前的研究中发现TOX基因与肥胖相关，这就提示我们TOX基因可能是MVCD的易感基因。TOX基因是位于人类第8号染色体上的蛋白质编码基因。在此次研究中发现，该基因的 rs1526167位点与 DN、DR、PDR、MVCD均有相关性。本研究为进一步了解和探讨MVCD的遗传背景提供了有意义的线索，但由于MVCD的发生发展是多种遗传因素和环境因素的共同作用所决定的，所以还需进一步进行更大样本量的、全基因组水平的研究。

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