扎兰屯地区鸡大肠杆菌病病原分离鉴定

内蒙古 张金宝 白宝霞

扎兰屯地区鸡大肠杆菌病病原分离鉴定

内蒙古 张金宝 白宝霞

本文从扎兰屯地区发病鸡群中分离出致病性大肠杆菌18株，分离率为90%，对18株菌进行了血清型鉴定，鉴定出6种不同的血清型，分别为O78、O2、O88、O57、O100和O35。其中O78、O2、O57是主要血清型，占定型总数的66.67%。

鸡；大肠杆菌病；病原分离鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

扎兰屯地区6个不同的鸡场疑似大肠杆菌病的30只病、死鸡。

1.1.2 培养基

麦康凯琼脂、营养琼脂、普通肉汤培养基、葡萄糖蛋白胨、伊红美蓝琼脂、琼脂粉等试剂、MH营养琼脂，由杭州天和微生物试剂有限公司生产。

1.1.3 革兰氏染色液

购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.4 微量生化发酵管

肠杆菌科细菌生化编码鉴定管GYZ-15E，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.5 实验动物

95只雏鸡，购自扎兰屯种鸡场。

1.1.6 大肠杆菌“O”型抗原标准血清

购自中国兽医药品监察所。

1.1.7 标准菌株

大肠杆菌标准菌株ATCC25922,购自中国兽医药品监察所。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离培养

无菌采取病死鸡心血、肝脏、脾脏，分别接种于普通肉汤、麦康凯琼脂和伊红美蓝琼脂培养基上，37℃培养24h，挑选麦康凯琼脂平板上砖红色菌落接种营养琼脂斜面进行纯培养，培养后胶塞密封，置4℃冰箱保存备用。同时另挑选单个菌落涂片革兰氏染色，进行菌体形态和染色特征的观察。

1.1.2 生化试验

用接种针在培养基上挑取单个菌落，接种于生化管中，置于温箱中37℃培养36h后观察结果。

1.2.3 血清型鉴定

将分离符合大肠杆菌特性的纯培养物接种于普通琼脂斜面，37℃培养24h，用灭菌的生理盐水5-6 ml冲洗，洗下菌苔，置于灭菌的西林瓶中，封口后，经121℃高压2h，破坏其K抗原，得菌体抗原(即O抗原)，置于4℃冰箱中。用大肠杆菌标准O抗原对18株分离菌株在玻片上做凝集试验，用接种环取一环高压抗原（0.05ml）涂于玻片上，再取一环血清混合于菌液中，静置0.5min,观察是否出现絮状沉淀或颗粒状凝块，同时，用高压抗原和0.5%石炭酸生理盐水混合作对照，观察有无自凝现象。

1.2.4 攻毒试验

（1）大肠杆菌悬液制备

取分离菌的24纯培养物培养5ml置于离心管，3000r/min离心15min，抽取上清液后，用5ml生理盐水稀释菌泥。充分摇匀，每1ml菌液中含有菌量约为6×108CUF,保存于4℃冰箱。

（2）对鸡致病性试验

把95只雏鸡随机分成19组，每组5只，把制备好的18株菌液分别接种于18组鸡，每只鸡经口接种0.2ml大肠杆菌菌液，约为1.2×108CUF，另外一组鸡做对照组，每只鸡接种生理盐水0.2ml。连续观察7天，观察实验组及对照组鸡的饮食，精神状态，是否死亡等，7天后对所有鸡进行扑杀，并做病理解剖。

2 结果

2.1 细菌分离结果

从20份病料中分离得到18株大肠杆菌，分别命名为 X1、X2、X3、X4、X5、X6、D1、D2、D3、B1、B2、B3、N1、W1、W2、C1、C2、C3，分离率为 90%。分离菌均在普通琼脂平板上长出表面光滑、湿润、半透明、灰白色、圆形微凸起，中等大的菌落。在血液琼脂平板上长出菌落较大，边缘整齐，并有隆起的灰白色菌落，多数不溶血。均在麦康凯琼脂平板上，形成中等大小的砖红色菌落，在伊红美蓝琼脂平板上，形成带有金属光泽的紫黑色菌落，在SS琼脂上成粉红色菌落。在肉汤培养基37℃培养24h后，呈均匀混浊，管底有淡白色粘稠沉淀，管壁液面有菌环。

2.2 染色镜检的结果

病料及培养物涂片革兰氏染色镜检均可见两端纯圆，多数散在排列，革兰氏阴性短杆菌。

2.3 生化试验结果

18株分离菌生化试验结果表明，分离菌均符合大肠杆菌的生化特性，对硫化氢、苯丙氨酸、尿素、丙二酸盐、V-P、枸橼酸盐的生化反应呈阴性，对山梨醇、赖氨酸、靛基质反应呈阳性，有10株菌（占55.6%）对鸟氨酸生化反应呈阳性，8株菌（占44.4%）呈阴性。如表1。

表1 18株分离菌的生化试验结果

该结果经查阅肠杆菌科细菌生化鉴定编码册（15系统）知，编码分别为0124和0134，鉴定值分别为68.82%和93.71%，对应菌名均为大肠杆菌。

2.4 血清型鉴定结果

在分离的18株大肠杆菌中，除1株未定型外，共确定了6个血清型，分别是O78、O2、O88、O57、O100和 O35。血清型 O78为 5株，占27.78%；O2为4株，占22.22%；O57为3株，占16.67%；O88为2株，占11.11%；O35为2株，占11.11%；O100为1株，占5.56%；未定型的1株。其中，O78、O2、O57为扎兰屯地区的主要血清型，占定型总数的66.67%，如表2。

表2 18株大肠杆菌的血清型鉴定结果

2.5 攻毒试验结果

将攻毒菌液接种雏鸡后，均表现为精神沉郁、食欲下降或废绝、垂翅、呼吸困难等，在12h以后，雏鸡大量死亡，在7d内，有82只鸡死亡，死亡率为86.32%，对照组雏鸡全部存活。剖检死亡雏鸡，表现为败血症、纤维素性心包炎、心包积液、肝周炎。从死亡的雏鸡肝、心、脾等脏器回收菌的形态染色、生化特性与接种菌完全一致。

3 讨论

本次试验从扎兰屯地区六个鸡场中的20只病死鸡中分离出18株大肠杆菌，经过染色镜检、菌落形态判断，和生化鉴定，均符合大肠杆菌的特征。说明根据大肠杆菌病的临床症状和病理变化来判断，绝大多数鸡为大肠杆菌感染。

动物致病性回归试验表明，再次接种分离菌株的鸡，出现了典型的大肠杆菌病临床特征，解剖病死鸡观察，基本符合大肠杆菌病的病理变化，再次从病死鸡血液、肝脏、脾脏中分离菌株，经过鉴定，符合大肠杆菌的特征。接种后的雏鸡，有的很快死亡，有的过几天死亡，甚至有的雏鸡耐过，说明分离出的18株大肠杆菌，有的致病性很强，有的致病性稍弱。

18株大肠杆菌进行了血清型鉴定，除一株未定型外，17株菌分属6个血清型，分别是O78、O2、O88、O57、O100 和 O35，其中 O78 为 5 株，占27.78%；O2为4株，占22.22%；O57为3株，占16.67%，这三个血清型确定为本地大肠杆菌主要血清型，一共占鉴定菌株的66.67%，其中O78、O2两个血清型与文献上报道的大肠杆菌主要血清型相一致，而O57这一血清型和以前文献上报到的血清型比较是不常见的。

（作者单位：张金宝，内蒙古扎兰屯农牧学校教务科；白宝霞，内蒙古呼伦贝尔市新巴尔虎右旗兽医局）

（编辑 王旸）