RRLC法快速测定克咳胶囊中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和吗啡

苏 丹，宋永贵*，魏斌斌，范荣华

(1.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西南昌 330006;2.沈阳药科大学，辽宁沈阳 110016)

克咳胶囊由麻黄、罂粟壳、甘草、苦杏仁、莱菔子、桔梗、石膏共七味中药组成，具有止咳、定喘、祛痰的功效，是被广泛应用的咳嗽类非处方中药制剂，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》(第17册)。麻黄和罂粟壳是方中君药，所含盐酸麻黄碱，盐酸伪麻黄碱和吗啡是主要有效成分［1-3］，具有一定成瘾性和毒性，部颁标准中并没有对其进行定量控制的方法。此外，盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱互为差向异构体，在药理活性上具有差异［4-5］，近年报道，盐酸麻黄碱较盐酸伪麻黄碱表现出更强的平喘效果［6］。因此，建立分离和测定克咳胶囊中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和吗啡的方法，是提高制剂质量控制水平的迫切需求，对增强其临床应用的有效性和安全性具有重要意义。

已有文献报道采用HPLC法测定克咳胶囊中的盐酸麻黄碱［7-8］，却并未对其和盐酸伪麻黄碱进行分离，因此未能实现该制剂中盐酸麻黄碱的准确测定。由于二者互为差向异构体，分离测定存在一定难度，常采用CE法［9-10］进行分离，在HPLC法或GC法中，也以衍生化法［11-12］或离子对试剂［13］多见，样品处理过程或流动相条件繁琐苛刻。本实验采用高分离度快速液相色谱(Rapid Resolution Liquid Chromatography，RRLC)，经过前期大量实验摸索，最终建立流动相组成简单、分离效果佳，且重复性好、分析时间短的克咳胶囊中3种主要生物碱盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和吗啡同时定量测定方法，为更好地监控制剂的生产以及保障产品质量提供依据。

1 仪器与试药

Angilent 1290 Infinity RRLC型液相色谱仪(美国Agilent公司)，AR-5120天平(瑞士Metrler toledo公司)，MILLI-Q型超纯水仪(美国Millipore公司)。乙腈(美国Fisher试剂公司)、乙酸(美国Sigma-Aldrich公司)、乙酸铵(美国Sigma-Aldrich公司)为色谱纯，水为去离子水，其他所用试剂均为分析纯。供含量测定用盐酸麻黄碱对照品(批号:171241-201007)、盐酸伪麻黄碱对照品(批号:171237-200806)、吗啡对照品(批号:171201-200822)均购自中国药品生物制品检定所。克咳胶囊(贵州益佰制药股份有限公司，0.3 g/粒，批号为111215，120209，120417)。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取在60℃减压干燥2 h的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和吗啡对照品15.3、13.62、12.86 mg，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液。精密吸取1 mL混合对照品贮备液，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，制成盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、吗啡质量浓度分别为61.2、54.48、51.44μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取本品20粒，精密称定，计算平均质量。取内容物0.5 g，精密称定，置50 mL量瓶中，精密加入氨试液1 mL与三氯甲烷50 mL，称定质量，超声45 min，放冷，再称定其质量，用三氯甲烷补足其减失的质量，摇匀，滤过，精密取续滤液5 mL，加入2%盐酸无水乙醇溶液2 mL，摇匀，置水浴锅上蒸干，残渣加0.1%盐酸溶液10 mL，超声使之溶解完全，定容至10 mL量瓶中，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3 阴性样品溶液制备 按处方比例分别除去麻黄和罂粟壳药材的其他药材适量，依照克咳胶囊制备工艺和供试品溶液的制备方法制得不含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和吗啡的溶液，作为阴性样品溶液。

2.2 色谱条件与系统适应性试验 Angilent ZORBAX SB-C8色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8μm);流动相为乙腈-2 mmoL/L乙酸铵水溶液(含0.04%乙酸)(4∶96);体积流量0.2 mL/min;检测波长为210 nm;柱温30℃;进样量5μL。在上述色谱条件下，样品中的各组分达到基线分离，样品中其他成分对盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和吗啡的测定无干扰。对照品溶液、样品及各阴性样品的色谱图见图1。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系考察 精密量取各对照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL，分别置 10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。取上述混合溶液各20μL进样，在上述色谱条件下进行分析。用峰面积对质量浓度进行线性回归，结果表明吗啡、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的回归方程分别为Y=46.65X+5.22(r=0.9992)、Y=20.67X－1.80(r=0.9997)、Y=18.64X －2.50(r=0.9994)。吗啡、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的线性范围分别为 3.06 ～ 48.96μg/mL，2.72 ～ 43.58μg/mL，2.57 ～41.15μg/mL。

2.3.2 精密度试验 取吗啡、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的混合对照品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，测定峰面积。吗啡、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱峰面积的 RSD分别为1.87%、2.04%和1.72%。

2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、10、12 h测定，结果表明，供试品溶液在10 h内稳定性良好，吗啡、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱峰面积的RSD分别为2.11%、1.75%、和1.29%。

2.3.4 重复性试验 取同一批号克咳胶囊内容物0.5 g，共6份，精密称定，按2.1.2项供试品制备项下方法操作，在上述色谱条件下进行分析测定，计算，吗啡、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的RSD分别为2.70%、2.19%和1.27%。

2.3.5 回收率试验 取已知含有量的克咳胶囊内容物适量，研细，取约0.25 g共9份，精密称定质量，3份为1组，每3组按低、中、高分别精密加入相当于样品中吗啡、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含有量的50%、100%、150%的对照品溶液，依2.1.2项下方法操作。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=9)Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

2.4 样品测定 取3批样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，依照2.2项色谱条件下进样测定，记录峰面积，按外标二点法计算各样品中吗啡、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的量，见表2。

表2 样品测定结果(n=3)Tab.2 Determination results of Keke Capsules(n=3)

3 讨论

3.1 色谱条件的确定 高分离度快速液相色谱(RRLC)技术的使用，极大地缩短了分析时间，使得本方法可以在15 min内实现克咳胶囊中该3种生物碱的分离测定。但在前期实验中发现，由于克咳胶囊中该3种生物碱成盐后极性很大，按照文献中所报道HPLC色谱中常采用的C18色谱柱，无法在RRLC色谱中得到重现，在本实验所考察的超高压C18色谱柱Phenomenex Kinetex C18(50 mm×2.1 mm，1.7μm，) 和 Angilent ZORBAX SB-C18(100 mm×2.1 mm，1.8μm)上均较难获得保留，最终选择超高压C8色谱柱(Angilent ZORBAX SBC8)，三者可以实现保留。

因麻黄碱与伪麻黄碱互为差向异构体，实验中发现在流动相中加入酸性溶液可以明显增加二者在该色谱柱保留行为的差异性，实现拆分。但酸的存在，同时又造成了麻黄碱与伪麻黄碱色谱峰较严重的拖尾现象。因此，需要调节流动相合适的pH值以改善二者的色谱峰型，实验考察了0.02%乙酸-2 mmol/L乙酸铵水溶液，0.04%甲酸-2 mmol/L甲酸铵水溶液，0.04%乙酸-2 mmol/L乙酸铵水溶液和0.08%乙酸-5 mmol/L乙酸铵水溶液四种体系，发现后两种作为水相流动相所获峰型良好，可满足测定要求。同时考虑到对色谱柱长期使用的保护，最终确定为0.04%乙酸-2 mmol/L乙酸铵水溶液(pH4.0)。

在上述确定的色谱柱和流动相条件下，吗啡的色谱保留行为与盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱区别明显，无需梯度洗脱，因此采用等度洗脱即可实现3者分离同时测定。

3.2 提取条件的确定 麻黄碱，伪麻黄碱与吗啡的pka值为9.58，9.74和7.0，分别具有碱性和弱碱性，因此将样品碱化后，采用三氯甲烷提取明显增加了提取效率。实验考察了甲醇、50%甲醇与氨试液-三氯甲烷提取，结果显示，经氨试液-三氯甲烷提取的样品效率高，杂质少。

3.3 小结 已有文献中对克咳胶囊盐酸麻黄碱量的测定，一直以来都有混淆，将盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱混为一体，影响了该制剂质量评价的合理性、科学性，本实验采用RRLC-UV法对盐酸麻黄碱，盐酸伪麻黄碱和吗啡这3种有效成分进行分离测定，实现了对克咳胶囊质量控制方法的提升。

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