烟酸转磷酸核糖激酶和丙酮酸羧化酶共表达对大肠杆菌BA002产丁二酸的影响

曹伟佳，苟冬梅，梁丽亚，刘嵘明，陈可泉，马江锋,2，姜岷

1 南京工业大学生物与制药工程学院 材料化学工程与国家重点实验室，江苏 南京 211816

2 中国石化扬子石油化工有限公司南京研究院，江苏 南京 210048

大肠杆菌 NZN111由于缺乏了乳酸脱氢酶的编码基因 (ldhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因 (pflB)而使副产物乳酸和甲酸的生产途径阻断，具有潜在生产丁二酸的能力。但同时由于NADH依赖的乳酸脱氢酶 (LDH)无法合成而限制了糖酵解过程中 NADH再生为 NAD+的过程，造成辅酶不平衡，导致该菌株厌氧条件下不能利用葡萄糖进行生长[1-3]。烟酸转磷酸核糖激酶(NAPRTase)是NAD(H)合成系统中的限速酶[4-6]。Liang等[7]通过在 NZN111中过量表达 NAPRTase基因 pncB，NAD+的浓度提高了 6.2倍，NADH/NAD+的比例大大降低，从而细胞生长和丁二酸产量有了大幅度提高。然而，发酵过程中伴随着大量的副产物丙酮酸生成，这是因为葡萄糖磷酸转移酶系统 (简称PTS)摄入胞外葡萄糖时，需要消耗磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)生成副产物丙酮酸，直接影响了丁二酸生产得率[8-9]。丙酮酸羧化酶(PYC)可催化丙酮酸到丁二酸前体草酰乙酸的反应，在重组大肠杆菌中表达有利于减少丙酮酸生成，提高丁二酸产量[10-12]。

本研究通过在E. coli BA002 (E. coli K12 △ldhA、△pflB)共表达烟酸转磷酸核糖激酶和外源丙酮酸羧化酶，构建了重组菌 BA016(BA002/pTrc99a-pncB-pyc)，增加NAD(H)的总量，降低NADH/NAD+比例，同时减少了副产物丙酮酸的积累并促进了丁二酸的合成。

1 材料与方法

1.1 材料

BA002、BA014、BA015 (BA002/pTrc99a-pyc)和BA016，由南京工业大学生物过程与系统工程实验室自主构建；质粒pTrc99a，由南京师范大学邵蔚蓝教授惠赠。所有菌株用 20%甘油保藏在–80 ℃。发酵培养基：LB培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，pH 7.0，氨苄青霉素的终浓度为100 µg/mL。血清瓶发酵为添加 20 g/L葡萄糖和16 g/L碱式碳酸镁；发酵罐发酵为添加35 g/L葡萄糖和 28 g/L 碱式碳酸镁。加入终浓度分别为0.5 mmol/L烟酸和0.3 mmol/L诱导剂IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)以诱导表达NAPRTase和PYC。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

种子培养：将保存于–80 ℃的菌种在加有氨青霉素的平板上活化，挑单菌落于5 mL种子培养基中，37 ℃、200 r/min培养12 h。

发酵培养：接1 mL种子培养液加入到150 mL LB，有氧培养6 h。将种子液以15%的接种量接入装有1.5 L发酵培养基的3 L发酵罐中，温度和搅拌速率分别维持在30 ℃和170 r/min。以0.2 L/min的速率持续通入CO2。

1.2.2 分析方法

细胞生长用紫外可见分光光度计于波长 600 nm处测定吸光度值，有机酸、葡萄糖用高效液相色谱法 (HPLC)检测。

测定蛋白浓度用 Bradford法[13]，以牛血清白蛋白 (BSA)为标准。NAPRTase酶活测定参照文献[14]。PYC酶活测定参照文献[15]。辅酶NADH与NAD+的浓度根据酶循环机理[16]测定。

2 结果与分析

2.1 对照菌与重组菌在血清瓶中纯厌氧发酵

由表1可知：72 h纯厌氧发酵后，BA002细胞干重仅为 0.52 g/L，合成了 1.57 g/L丁二酸，1.90 g/L丙酮酸。重组菌株BA014恢复了生长能力和发酵产酸能力，细胞干重是对照菌的 3.33倍，合成丁二酸5.04 g/L，但积累了4.71 g/L的丙酮酸。而BA015细胞干重为0.93 g/L，虽然丙酮酸减少至0.29 g/L，但合成的丁二酸只有3.61 g/L。重组菌BA016合成 15.68 g/L的丁二酸，比对照菌增加了7.97倍，而丙酮酸只有0.15 g/L。表2可知72 h厌氧条件下诱导后，BA016中 PYC的酶活增加至1.87 U/mg。BA014和BA016中NAPRTase的酶活明显高于BA002中的NAPRTase酶活。表2可以看出，重组菌株 BA016中 NADH/NAD+的比例从BA002中的0.60下降至BA014中的0.16和BA016中的0.05，该比例不断趋于辅酶平衡。

表1 不同菌株在LB培养基中72 h纯厌氧发酵结果Table 1 Results of exclusively anaerobic fermentations of the strains after 72 h in LB media

表2 不同菌株发酵72 h后PYC酶活、NAPRTase酶活和NAD(H)的测定Table 2 Enzyme assays and determination of the amount of NAD(H)in anaerobic fermentations of the strains after 72 h

2.2 BA016在3 L发酵罐中的纯厌氧发酵

由图1可以看出，发酵112 h后，共消耗了35 g/L的葡萄糖，菌体 OD600为 4.64，产生了 25.09 g/L丁二酸。41 h时，丙酮酸的浓度积累到3.23 g/L，随后开始下降，52 h时为0.09 g/L，而乙酸增加至2.35 g/L。表3可以看出41 h相比于0 h的PYC酶活显著增加至0.88 U/mg，此时代谢流从丙酮酸转向丁二酸的前体物草酰乙酸，这很可能是丙酮酸下降的原因。此外，41 h到64 h，NADH/NAD+下降了 4倍，丁二酸的生产效率达到最高，为0.4 g/(L·h)。说明下降的 NADH/NAD+对菌株生长和合成丁二酸具有促进作用。64 h后虽然葡萄糖消耗速率仍然很高，但是丁二酸生产效率下降，此时碳通量流向部分副产物的支路。酶活PYC的下降导致丙酮酸的积累，菌株在后期厌氧发酵时，NADH的不足导致苹果酸及富马酸的积累。

图1 BA016在 3 L发酵罐中厌氧发酵的细胞生长(OD600)、葡萄糖消耗及有机酸的生成Fig. 1 Anaerobic fermentation in 3 L fermentor by BA016.OD600 (open circle), glucose (filled square), succinic acid(open diamond), acetic acid (filled diamond), pyruvic acid(filled triangle), malic acid (open square).

表3 3 L发酵罐中不同时间段PYC的酶活和NADH/NAD+的比例Table 3 Determination of specific enzyme activity of PYC and NAD(H)at different time in 3 L fermentor

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