急性脑梗死大鼠模型针刺效应的经穴特异性研究的因子分析*

★ 常晓波 王舒,2 樊小农 张亚男 孟智宏 杨雪 石学敏,6

(1.天津中医药大学第一附属医院 天津 300193；2.国家中医药管理局脑病针刺疗法重点研究室 天津 300193；3.国家中医药管理局针刺量效关系三级实验室 天津 300193；4.江西中医学院附属医院 南昌 330006；5.天津工业大学数理学院 天津 300387；6.天津市针灸学重点实验室 天津 300193)

急性脑梗死大鼠模型针刺效应的经穴特异性研究的因子分析*

★ 常晓波1，4**王舒1,2***樊小农1,3张亚男1孟智宏1杨雪5石学敏1,6

(1.天津中医药大学第一附属医院 天津 300193；2.国家中医药管理局脑病针刺疗法重点研究室 天津 300193；3.国家中医药管理局针刺量效关系三级实验室 天津 300193；4.江西中医学院附属医院 南昌 330006；5.天津工业大学数理学院 天津 300387；6.天津市针灸学重点实验室 天津 300193)

目的：通过综合评价急性脑梗死大鼠模型的针刺效应来研究经穴效应的特异性。方法：以Zea-longa线拴法复制大脑中动脉缺血(MCAo)大鼠模型。造模成功后依据Zausinger六分法选择1-3分的大鼠入组。以随机对照设计原则设立基础对照组(正常组、假手术组、模型对照组、模型未干预组、尼莫地平组、人中旁组)和针刺组(内关组、委中组、三阴交组、尺泽组、人中组和非穴组)。而且针刺组内每个穴组采用正交设计法分别设置9个不同参数组合。每组12只，共60组。针刺干预组以提插手法针刺治疗，每12h 1次，共干预6次。并以神经行为学、脑血流、梗死率、微循环、光镜等为测量指标。利用因子分析计算样本的综合得分，并进行排序比较(以SPSS 17.0实现)。结果：针刺组内比较：每个经穴的针刺参数组合不同，则针刺效应亦不同。针刺组间比较：内关>尺泽>人中>三阴交>委中>非穴。经穴与非穴比较：穴位组>非穴组。针刺组与非针刺组比较：针刺组>非针刺组。结论：经穴具有针刺效应的特异性；而且经穴特异性是相对的。

脑梗死大鼠模型;针刺效应;综合评价;经穴特异性;因子分析

1 前言

目前国际上对针刺治疗的部分疾病进行循证医学研究，结果有否定经穴特异性的趋势。德国、荷兰、英国等一些研究机构在针灸治疗慢性哮喘、低背痛、针灸戒烟临床评价上得出无效的结论，认为针灸与伪针灸没有明显差异。[1-3]穴位是针灸学的基础，离开经穴特异性，针灸学将沦为简单刺激疗法而失去合理内涵。而国内针灸研究重视针刺效应，对经穴的特异性研究较少，如研究针刺镇痛时，多是从神经生物学和神经化学的角度出发，针刺对内脏功能调节方面也不重视经穴特异性效应影响因素的研究等。多数临床研究，把经络辨证作为配方取穴的指导思想，但在“宁失其穴，勿失其经”的理论下，对穴位本身特异性效应没有给予足够重视，制约了“循经取穴”这一学术理论的发展。为此，我院承担了“基于脑梗死的经穴特异性效应及其关键影响因素研究”的重大课题，拟从临床和基础研究方面，通过严格的科学设计进一步证实经穴的特异性效应，对于针灸学科的生存和发展具有重要意义。

另外，手针刺法及电针参数是影响经穴特异性效应的关键因素，此领域中存在许多的问题，大多停留在理论探讨上，定性定量的实验分析较少。[4-5]因此，优化影响针刺效应的刺激参数体系，明确辨证、选穴、施术与针刺效应作用机理，是取得针刺效应的关键。该体系的建立将明确针刺效应的关键因素并确定关键因素的定量特征，为临床针刺规范化治疗提供依据。

本文主要是根据因子分析构筑针刺效应的综合评价模型所确定的多指标权重系数，计算出所有样本的综合效应评分并将之进行排序比较(以SPSS 17.0实现)，进行针刺效应的综合评价，从而研究经穴的特异性，并筛选脑梗塞最优针刺处方。

2 实验材料与方法

2.1 试剂与仪器

水合氯醛(分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司)；DRT4激光多普勒血流仪(美国惠普公司生产，由瑞典百灵威医疗仪器中国公司提供)；XW-4彩色微循环检测仪(合肥响石电子科技有限公司提供)；Strong 90牙钻。

2.2 动物来源及分组：

动物来源：选用体重250-300g左右的三级动物(specific pathogen free animals，SPF)的成年健康雄性Wistar大鼠，由中国医学科学院实验动物中心提供,动物合格证编号为(京海)动防(合)字第050275号。

分组：依据随机对照原则将大鼠分为基础对照组(正常对照组、假手术组、模型对照组、模型未干组、尼莫地平组、人中旁组和针刺组(内关组、委中组、尺泽组、三阴交组、人中组和非穴组)。其中，每个针刺组又分为9个参数组。每组12只，共60组。

2.3 MCAo动物模型的复制及造模成功判定

MCAo动物模型的复制：参照Zea-Longa线拴法[6]复制大脑中动脉缺血模型(middle cerebral artery occlusion，MCAo)。

造模成功判定：大鼠造模清醒后，按Zausinger六分法[7]对其神经功能进行评分，去除评分为4分和5分的动物。

2.4 针刺干预方法

2.4.1 穴位定位与治疗方法

依据《实验针灸学》[8]的常用实验动物针灸穴位定位，选用内关、委中、尺泽、三阴交、人中和非穴等共6个穴位进行提插手法针刺。内关穴定位：前肢内侧，离腕关节约3mm左右的尺桡骨缝间，在“内关”穴直刺3mm。委中穴定位：膝关节正后方凹陷中，在“委中”穴直刺5mm。尺泽穴定位：在肘弯横纹偏外的凹陷中，在“尺泽”穴直刺5mm。三阴交定位：后肢内踝尖直上10mm，在“三阴交”穴直刺3mm。人中穴定位：位于唇裂鼻尖下1mm正中处，在“水沟”穴向鼻中隔方向针刺2mm。非穴定位：选取大鼠患侧(即右侧肢体)肋下髂嵴上10mm的固定点处胁下处针刺作为对照，干预6次。

2.4.2 分组干预方法

针刺组：造模成功后待大鼠清醒后在相应时间段内，实施针刺干预，共干预6次。

模型对照组：造模成功后，待大鼠完全清醒，不实施任何针刺，立即给予脑血流量、微循环的测定，之后断头取材(脑组织)测量光镜、梗死率等指标。

模型未干组(未针刺组)：造模成功后在相应时间段内，用与针刺组实施同等条件的抓取，但不实施任何针刺干预，共抓取6次。

正常组：不实施造模手术及针刺干预，但也同等条件抓取，同样抓取6次。

假手术组：除不插鱼线外，其他操作与手术组相同，且Zausinger六分法评分为5分的动物。

尼莫地平组：造模成功后在相应时间段内，用尼莫地平注射液0.15mg/kg,日1次，腹腔注射。

人中旁组:大鼠人中线之左侧(患侧)，离人中穴旁开5mm处，针刺干预6次。

2.4.3 针具选择

针具用苏州医疗用品厂生产的“华佗牌”毫针，长1.5寸，直径0.32mm。

2.4.4 干预参数

除正常对照组、假手术组、模型对照组及尼莫地平组外，其余各组干预方法，依据针刺参数的2因素(针刺频率与针刺时间)3水平(即频率的180、120、60次/min与时间的5、60、180s))的正交设计法，进行经穴特异性研究(针刺参数组合参见表1)。

2.4.5 干预时间

针刺组各个穴组，造模成功后待大鼠清醒约1小时左右，即给予第1次针刺干预。以后每12h干预1次，72h共针刺6次。

表1 9种不同针刺参数组合

2.5 效应指标

2.5.1 MCAo大鼠神经功能评分

鼠造模后，按Zausinger六分法对其神经功能进行评分，去除评分为4分和5分的动物。

2.5.2 软脑膜脑血流及微循环的测定

包新民[9]的方法：将大鼠固定在立体定位仪上，取头皮正中切口，剪开骨膜，暴露前囟，于前囟后1mm，中线向左旁开3mm处为中心开一骨窗，其深度以手下有突破感为度。用DRT4激光多普勒血流仪(美国惠普公司生产，由瑞典百灵威医疗仪器中国公司提供)，连续动态监测缺血局部脑组织血流量。并用XW-4彩色微循环检测仪(合肥响石电子科技有限公司提供)测量软脑膜微循环。

2.5.3 脑缺血面积(梗死率)的测定

神经功能评分后，取脑，分离去除嗅球、小脑和低位脑干，大脑部位等分切成5片，置于含4%TTC(氯化三苯四氮唑染色法)和1mol/L K2HPO4(磷酸氢钾)溶液中，避光，37℃温孵30min；切片扫描；以IPWIN60进行图像分析后，主要以梗死面积均值与总面积均值的比值计算梗死面积。

2.5.4 光镜观察

治疗后第3d，麻醉状态下将大鼠断头取脑，迅速剥离脑组织，以生理盐水冲洗干净。为充分观察针刺对缺血脑组织不同部位病理形态学的影响,分别取皮层、海马、纹状体3个部位的脑组织制成光镜标本。于400倍高倍镜下，随机选取两个视野，取均值。计数正常神经细胞数、微血管数、炎性细胞数、阳性细胞(坏死细胞)数及噬神经细胞数。

2.6 统计学方法

应用因子分析所构筑的脑梗塞大鼠针刺效应综合评价模型[10]计算出每个穴位在不同参数组合下的针刺效应综合得分(平均分)，然后作排序比较，来研究经穴效应的特异性。

3 结果

根据因子分析方法所构筑的脑梗塞大鼠针刺效应综合评价模型计算出每个穴位在不同参数组合下的针刺效应综合得分(平均分)。如表2所示。

表2 针刺效应综合得分(平均分)

3.1 针刺组综合效应得分(平均分)比较

3.1.1 针刺组内的针刺效应比较

内关穴以参数8(60次/min，180s)为最优，其次为参数10(180次/min，60秒)，参数7(180次/min，5s)，参数9(120次/min，5s)，最差的是参数5(如图3所示)。

图3 内关穴不同参数针刺效应比较

图4 委中穴不同参数针刺效应比较

图5 尺泽穴不同参数针刺效应比较

图6 三阴交穴不同参数针刺效应比较

委中穴以参数2(60次/min，5s)为最优，其次为参数4(180次/min，180s)，最差的是参数8(如图4所示)。

尺泽穴以参数8(60次/min，180s)为最优，其次为参数7(180次/min，5s)，再次为参数9(120次/min，5s)，最差的是参数2(如图5所示)。

三阴交以参数6(120次/min,180s)为最优，其次为参数4(180次/min，180秒s)，最差的是参数7(如图6所示)。

人中穴以参数4(180次/min，180s)为最优，其次为参数7(180次/min，5s)，最差的是参数8(如图7所示)。

非穴以参数10(180次/min，60s)为最优，其次为参数4(180次/min，180s)，最差的是参数6(如图8所示)。

图7 人中穴不同参数针刺效应比较

图8 非穴不同参数针刺效应比较

图9 针刺组间的针刺效应比较

图10 经穴组与非穴组的针刺效应比较

图11 非针刺组的针刺效应比较

图12 总组别(针刺组与非针刺组)组间的针刺效应比较

3.1.2 针刺组间针刺效应比较

内关(0.15)>尺泽(0.07)>人中(-0.01)>三阴交(-0.03)>委中(-0.04)>非穴(-0.10)(如图9所示)。

3.1.3 经穴与非穴的针刺效应比较

穴位组(除外非穴)(0.03)>非穴(-0.10)(如图10所示)。

3.2 非针刺(基础对照组)组综合效应得分(平均分)比较

正常组(1.05)>假手术组(0.48)>尼莫地平组(0.27)>人中旁组(-0.21)>模型未干预组(-0.39)>模型对照组(-1.79)(如图11所示)。

3.3 针刺组与非针刺组的针刺效应比较

3.3.1 总组别(针刺组与非针刺组)组间的针刺效应比较

正常组(1.05)>假手术组(0.48)>尼莫地平组(0.27)>内关组(0.15)>尺泽组(0.06)>人中组(0.03)>三阴交组(-0.03)>委中组(-0.04)>非穴组(-0.10)>人中旁开组(-0.21)>模型未干预组(-0.39)(如图12所示)。

3.3.2 针刺组与非针刺组(基础对照组)的针刺效应比较

针刺组(0.01)>非针刺组(-0.10)(如图13所示)。

图13 总组别(针刺组与非针刺组)组间的针刺效应比较

由以上分析得出如下结果：针刺组内针刺效应比较：每个经穴的针刺参数组合不同，则针刺效应亦不同。针刺组间针刺效应比较；内关>尺泽>人中>三阴交>委中>非穴；经穴与非穴针刺效应比较：经穴组>非穴组；针刺组与非针刺组(基础对照组)针刺效应比较：针刺组>非针刺组。

4 结论

经穴具有针刺效应的特异性；经穴特异性是相对的。

5 讨论

针刺效应综合评价是把各个具体指标的优劣综合起来，对某一针刺措施或针刺治疗方案进行评价的量化方法。在概率分析中用于综合评价的主要方法有多元统计分析方法如主成分分析或因子分析、聚类分析等。本实验以随机对照为设计原则，应用2因子3水平的正交设计方法，以脑梗塞大鼠模型为载体，以醒脑开窍针法中的内关、尺泽、委中、三阴交、人中等单穴为研究对象，以神经行为学、脑血流、梗死率、微循环、光镜为检测指标，将变量方向越小越好的指标“负指标”化，将样本数据进行主成分-因子分析，构筑针刺效应的综合评价模型，并以此来确定多指标的权重系数，计算出所有样本的因子得分及综合得分，并对样本的综合效应评分进行排序，从而进行针刺效应的综合评价,以此来研究经穴效应的特异性。研究表明经穴特异性是普遍存在的，而且是相对的。为了获得较好的针刺效应，针刺穴位时应该选取每个经穴的较优参数。经过筛选，针刺治疗脑梗塞的较优针刺处方为内关8(60次/min，180s)、尺泽8(60次/min，180s)、三阴交6(120次/min，180s)、委中2(60次/min，5s)、人中4(180次/min，180s)。本实验由于受到统计方法、解决方案的限制，所以选择和联合应用多元统计方法有利于获得正确的结论。

本实验中人中穴的最优参数(参数4，即180次/min，180s)与樊氏[11]用正交试验、析因分析、单因素方差分析筛选“水沟”穴最佳刺激参数的研究结果是一致的。这更加证实了针刺参数是影响针刺效应的重要因素，加强针刺刺激量标准的研究，对于提高针刺疗效有重要意义。

总体上看，非穴的针刺效应不如经穴，但是非穴10(180次/min，60s)与委中穴2(60次/min，5s)、人中穴4(180次/min，180s)的最优值相比，有较好的针刺效应，说明非穴只要达到一定的针刺参数值，也可引起较好的针刺效应。这说明针刺是个复杂的过程，有人[12]认为非穴出现针刺效应可能是应激反应，也有人因此质疑经穴特异性,[13]而笔者认为经穴既有特异性的一面，也有非特异性的一面。可以肯定在脑梗死的急性期经穴具有针刺效应的特异性。非穴10的针刺效应可能迫使我们要从动态上重新认识经络腧穴的实质。

从本实验设计来看还是有一定的局限性，就是针刺干预时间短，仅为3d(72h)，此时期正是脑梗死的急性期。要想合理解释非穴10的针刺效应并确定非穴10是否有稳定的针刺效应，还需延长针刺干预时间以便进一步研究。

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FactorAnalysisofStudyonAcupointSpecificityofAcupunctureEffectBasedonModelRatswithAcuteCerebralInfarction*

CHANGXiao-bo1,4,WANGShu1,2**,FANXiao-nong1,3***,ZHANGYa-nan1,YANGXue5,SHIXue-min1,6

1.TheFirstHospitalAffiliatedtoTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193;2.ClassⅢLaboratoryofAcupunctureQuantity-EffectRelationshipAffiliatedtotheState,AdministrationofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193;3.CriticalResearchRoomofEncephalopathyAcupunctureTherapy,Tianjin300193;4.MoxibustionCollegeofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006;5.MathematicsCollegeofTianjinPolytecnicUniversity,Tianjin300387;6.TianjinKeyLaboratoryofAcupuncture&MoxibustionScience,Tianjin300193

Objectives: The objective is to study acupoint specificity by factor analysis based on comprehensive evaluation of the acupuncture effect of rat models with the middle cerebral artery occlusion (MCAo). Methods: Duplicated MCAo models by Zea-longa's thread ligature and chose rats with 1-3 scores assessed by Zausinger's six-point method to be grouped. The rats were divided into 6 basic control groups(including normal group, sham group, model control group, model group without intervention, Nimodipine group, lateral-to-Renzhong group) and 6 acupuncture groups(including Neiguan(PC6) group, Weizhong(BL40) group, Sanyinjiao(SP6) group, Chize(LU5) group, Renzhong(DU6) group and non-acupoint group) according to the randomized and controlled design principle. In the acupuncture groups, for every meridian acupoint or needling site, 9 different parameter combinations were set respectively by the orthogonal intersection method. The rats were treated by acupuncture with a lifting-thrusting manipulation once every 12 hours, in total six times. There are 12 rats in every group, in total 60 groups. Neurobehavioral scores, cerebral blood flow, infarction rate, microcirculation, light microscope, etc. were measured. The factor analysis was applied to compute the comprehensive effect scores of the samples and then to be sorted out with SPSS17.0. Results: Comparison within the acupuncture group: different parameter combinations of each acupoint can get different acupuncture effect. Comparison among the acupuncture groups: Neiguan > Chize > Renzhong > Sanyinjiao > Weizhong > Nonacupoint. Comparison between the acupoint group and non-acupoint: acupoint group > non-acupoint. Comparison between acupuncture group and non-acupuncture group: acupuncture group > non-acupuncture group. Conclusion: The acupoint has the specificity of acupuncture effect, and the acpoint specificity is relative.

Model Rats of MCAo; Acupuncture Effect; Comprehensive Evaluation; Acupoint Specificity; Principle-component-factor Analysis

国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(项目编号：2012CB518505,2006CB504504，2010CB530500)。

**作者简介：常晓波(1971-)，女，博士，主要从事针灸治疗脑血管病、针灸量学及经穴特异性及热敏灸研究工作，E-mail：changxiaobo314@qq.com。

***通讯作者：王舒(1965-)，男，主任医师、教授，研究方向:针刺治疗中风病、老年病、痛证、针刺量化、经穴特异性研究，Tel：022-27432207，E-mail:wangs2008@163.com。

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B

2013-10-01)