23个STR基因座荧光复合扩增体系的法医学应用评估

唐建新，李双琳，刘 宏，翁玮霞，刘 超，杜蔚安，黄 杰

（1.南方医科大学 法医系 广东 广州510515；2.广州市刑事科学技术研究所 广东省法医遗传学重点实验室，广东 广州510080；3无锡中德美联生物技术有限公司，江苏 无锡214174）

复合STR分型技术因具有高灵敏度，高鉴别能力以及分型标准化等优点而成为当前法医学鉴定的主要技术。然而，现在广泛使用的商品化试剂盒主要针对欧美人群研发，且在Amelogenin缺失的情况下易导致性别误判[1]，因此，建立适合我国人群的复合扩增体系十分必要。本研究新建立的23个基因座STR复合扩增体系保留CODIS系统中全部基因座，新增PentaD，PentaE，D2S1338，D19S433，D12S391，D2S441，D10S 1248，DYS391，D6S1043九个基因座，具有良好的兼容性、更高的非父排除率和个体识别率。为了评估该复合扩增体系的适用性，本文就其特异性、同一性、准确性、均衡性、灵敏度及对混合样本、降解检材、脱落细胞检材的分析能力及法医学应用参数进行了评估。

1 材料和方法

1.1 样本

灵敏度、准确性、均衡性试验样本采用标准男性样本9948。特异性及同一性试验样本采用狗、猫、猪、牛、鸡、鸭、羊、鼠、兔、鱼10种常见动物血痕30份，来源于科研积累；30例（男、女各15例）同一个体肌肉组织、血痕、带毛囊的毛发样本，来源于日常检案积累。案例检材样本为脱落细胞检材30份，降解检材30份，Amelogenin基因缺失男性样本3份，来源于日常检案积累。男女混合样本制备方案为：浓度为0.05ng/μL、0.1ng/μL、0.2ng/μL、0.5ng/μL 的 标 准 男 性样本 9948 分别与浓度为 0.5ng/μL、5.0ng/μL、50ng/μL的标准女性样本9947A等体积混合，得到男女DNA比例为 1∶10，1∶5，1∶2.5，1∶1，1∶100，1∶50，1∶25，1∶10，1∶1000，1∶500，1∶250，1∶100 的混合样本。 群体遗传学调查样本为196份广州汉族无关个体血痕。

1.2 主要仪器和试剂

EQ1000法医提取试剂盒（北京东胜创新生物科技有限公司），AGCU Expressmarker 23荧光检测试剂盒及相应的SIZ-500内标（无锡中德美联生物技术有限公司）。Freedom EVO全自动化工作站平台，ABI9700型扩增仪，ABI3130XL全自动遗传分析仪

1.3方法

1.3.1 DNA提取

采用基因组Freedom EVO全自动化工作站以磁珠法提取基因组DNA，磁珠提取试剂盒为北京东胜创新生物科技有限公司的EQ1000法医提取试剂盒。

1.3.2 PCR扩增

应用25μL标准体系进行扩增：特异性测试、同一性测试、灵敏度测试、疑难检材测试所用体系为：PCR 反应液 10.0μL，引物混合液 5.0μL，C-taq 1.0μL，templete 1.0μL，sdH2O 8.0μL。混合样本测试所用体系为：PCR 反应液 10.0μL，引物混合液 5.0μL，C-taq 1.0μL，模板 2.0μL，双蒸水 12.0μL 扩增应用 ABI9700型扩增仪，热循环条件： 95℃ 2min；94℃ 30s，60℃ 1min，72℃1min，10 个循环； 90℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 10min，20个循环。

1.3.3 电泳与分型

取1.0μL PCR产物加入12μL Hi-Di甲酰胺和0.5μL内标的混合液中，在AB 3130XL遗传分析仪上进行毛细管电泳。使用GeneMapper ID3.2软件进行基因分型。

1.3.4 统计

采用powermarkerV3.25计算杂合度观察值（H），多态信息含量（PIC），使用powerstate计算个人识别率（DP），非父排除率（PE）。

2 结果

2.1 灵敏度检测

25μL体系中，加1μL模板，模板浓度及扩增结果（见图1）。分型结果显示模板浓度在0.05～1.00ng之间时，扩增均衡性、峰高符合要求。

2.2 准确性及均衡性检测

检测标准男性样本9948，各基因座等位基因分型准确，无重叠，无明显偏离，峰高均在200RFU以上，杂合子两峰的峰高比例均大于70%，峰值均衡。与商品化试剂盒Sinofiler比较，效果相当。

2.3 男女混合样本检测

女性样本9947A为50ng时，含0.05ng男性样本9948的混合样本检测不到AmelY，DYS391；含0.1ng男性样本9948的混合样本能检出男性成分；含0.2ng男性样本9948的混合样本能检出Amel Y（RFU=54），含0.5ng男性样本9948的混合样本能检出Amel Y（RFU=177）及 DYS391（RFU=128）。

图1 灵敏度测试分型图谱

女性样本9947A为5ng时，按0.05ng 9948∶5ng 9947混合，9948只能检测出 DYS391（RFU98） Amel（RFU95），常染色体检测不到；按 0.1ng 9948 ∶5ng9947混合，检测出 DYS391（RFU=441）， Amel（RFU=297），常染色体检测不到；按0.2ng9948∶5ng9947混合及0.5ng 9948∶5ng9947，9948时，能检出为混合样品。

女性样本9947A为0.5ng时，所有混合样品均能检测出男性成分。

2.4 特异性、同一性检测

对狗、猫、猪、牛、鸡、鸭、羊、鼠、兔、鱼 10 种常见动物血痕DNA复合扩增后，均未检见特异分型。检测已知同一男性个体肌肉组织、血痕、带毛囊的毛发，均获得完整分型，无等位基因丢失及分型错误。

2.5 案例检材检测

对脱落细胞检材30份，降解检材30份进行分型，结果表明所有分型与Sinofiler分型结果一致（见图2～3）。

图2 脱落细胞检材EX23复合扩增体系STR分型

图3 降解检材EX23复合扩增体系STR分型

2.6 缺少牙釉基因的男性样本检测

检测3例Amel Y丢失的男性样本。使用EX23进行扩增，电泳后结果显示Amel Y未检测出分型，DYS391均成功分型。

2.7 多态性检测

对广东地区汉族无关个体血痕196份进行DNA分型，统计结果显示除性别判断位点以外基因座的基因型分布符合H-W平衡（P＞0.01），杂合度观察值（H）在0.658～0.898 之间，多态信息含量（PIC）在 0.378～0.865之间，累计个人识别（TDP）率达0.999999999，三联体累计非父排除率（CPE）达0.999999997。

表1 广东汉族人群23个STR基因座的法医学参数

3 讨论

在不同的地区和人群，STR基因座频率具有明显的差异[2]，因此不同的STR基因座往往被选择性地使用[3]。最近，美国FBI对13个CODIS基因座重新进行了评估，并最终确立了含20个STR基因座的扩展核心基因座[4-5]。

本文采用的复合扩增体系与以往的试剂盒相比，一个明显变化是在常染色体位点中新增了DYS391基因座用以辅助判断性别、提高分辨能力。现在广泛使用的商品化试剂盒均借助Amelogenin基因判断性别。通常AMELX的丢失变异不会导致性别的错判，而AMELY染色体的片段缺失、引物结合区的突变均将导致性别判断错误[6]。不同人群AMELY分型失败的频率差异较大，最高的是斯里兰卡，为8.3%，最低为意大利，仅0.008%[7]。中国男性群体中AMELY分型失败率为0.085%，可能的原因为Yp11.2的缺失而非引物结合区突变，且这种缺失无规可循[8]。为了避免性别错判，新试剂盒增加DYS391后，可以有效避免Amel Y丢失造成的性别误判。此外，对该复合扩增体系进行灵敏度检测时，当模版量为0.03ng时，虽然可检出全部基因座，但均衡性较差，D3S1338的杂峰干扰结果判读。因此，使用该复合扩增体系检测极微量检材时，应留意杂峰的干扰。

综上所述，本文采用的23位点复合扩增体系在常染色体位点中加入了Y染色体位点，提高了性别判断的准确性，与以往单纯依靠Amelogenin基因相比具有很大的改进；在体系检测中，各项性能指标均符合法医DNA检验的需要，可以应用于法医学实践。

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[6]Karl Zehethofer，Burkhard Rolf.A molecular analysis of three amelogenin negative males in two routine paternity test[J].Forensic Sci Int Genet， 2011，5（5）：550-551.

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