P2Y受体激动剂2-mesADP诱发脊髓背角小胶质细胞[Ca2+]i 升高

闵娅兰,程年群,田 虹,刘爱东,刘晓红,肖 智,曾俊伟

(遵义医学院 生理学教研室暨贵州省麻醉与器官功能保护重点实验室，贵州 遵义 563099)

P2Y受体激动剂2-mesADP诱发脊髓背角小胶质细胞[Ca2+]i升高

闵娅兰,程年群,田 虹,刘爱东,刘晓红,肖 智,曾俊伟

(遵义医学院 生理学教研室暨贵州省麻醉与器官功能保护重点实验室，贵州 遵义 563099)

目的观察体外培养的背角小胶质细胞P2Y受体激活对其[Ca2+]i的影响。方法培养并纯化脊髓背角小胶质细胞，采用激光共聚焦技术观察P2Y受体激活后小胶质细胞[Ca2+]i 的变化。结果P2Y 受体激动剂2-mesADP在10 μm即可引起小胶质细胞[Ca2+]i升高，当随着2-mesADP浓度增大，小胶质细胞[Ca2+]i升高更为明显。结论体外培养的大鼠脊髓背角小胶质细胞 P2Y受体激活可以促进细胞[Ca2+]i 升高。

脊髓背角; 小胶质细胞; P2Y受体

近年研究表明，脊髓背角小胶质细胞在神经病理性疼痛的发生发展中起着重要的作用。鞘内注射选择性的小胶质细胞活性抑制剂米诺环素可以缓解坐骨神经炎性痛、关节炎性痛、坐骨神经慢性压迫损伤及L5 脊神经切断等模型大鼠的痛觉过敏症状[1-3]。但最近通过形态学方法观察到P2Y6mRNA,P2Y12mRNA,P2Y13mRNA,P2Y14mRNA受体存在于脊髓背角小胶质细胞[4]。鞘内注射P2Y6受体拮抗剂MRS2578、P2Y12受体拮抗剂MRS2395、P2Y13受体拮抗剂MRS2211和P2Y14受体反义核酸均可以缓解大鼠神经病理性疼痛[4-5]，但其具体机制尚不清楚。因此，本实验采用离体培养脊髓背角小胶质细胞，观察P2Y 受体激动剂2-mesADP是否可以通过影响小胶质细胞[Ca2+]i。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SD 乳鼠由遵义医学院实验动物中心提供。主要试剂: DMEM/F12、DMEM高糖培养基及胎牛血清均为Hyclone 产品；OX-42抗体购自Abcam；抗体稀释液、山羊免疫组化试剂盒及DAB试剂盒均来自北京中山金桥公司；Fluo-4/ AM及F-127购自Dojindo；2-mesADP购自Sigma。主要仪器：激光扫描共聚焦显微镜，德国LeicaTCS2TN 型。

1.2 背角小胶质细胞的培养与鉴定 SD 乳鼠(lt;3 d)，乙醚麻醉,750 mL/L 乙醇消毒，,解剖显微镜下取出脊髓背角组织，1.25 mg/mL胰蛋白酶37 ℃消化20～30 min，加入含胎牛血清的培养基终止消化，吹打成细胞悬液，,接种于75 mL培养瓶内，放置于5% CO2、37 ℃培养箱内。培养10 d 后细胞铺满瓶底，置于180 r/min，37 ℃摇床2 h，得到高纯度小胶质细胞。接种在盖玻片上培养72 h后，4%多聚甲醛固定15 min，0.01 m PBS漂洗，加入小鼠源OX-42单克隆抗体(1∶500) ，37 ℃1 h ，4 ℃过夜后取出，加入山羊二抗，37 ℃1 h，0.01m PBS中漂洗，5 min×3次；即用型DAB显色，及时终止反应。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察ox-42阳性细胞为小胶质细胞。

1.3 激光共聚焦技术观察小胶质细胞内[Ca2+] i浓度变化 将小胶质细胞接种于盖玻片上,随机分为5组：加入: ①2-mesADP (0.01 μm)；②2-mesADP (0.1 μm)；③2-mesADP(1 μm) ；④2-mesADP(10 μm)；⑤2-mesADP (100 μm)。以未加药时小胶质细胞荧光强度为对照。各组细胞以Fluo-4/ AM (2 μm)荧光指示剂负载，37 ℃避光孵育30 min 后用DMEM高糖培养基漂洗3 遍，以少许DMEM高糖培养基覆盖细胞，避光待测。扫描技术参数为：激发波长488 nm，发射波长515 nm，分别加入上述药物,检测10 min，得到加药后钙荧光图像并存入计算机中，Ca2 +荧光强度的动态变化反映胞内游离Ca2 +浓度的变化。

1.4 统计学分析 所有计量资料均以表示，采用SPSS 13.0 统计软件分析。两组间差异显著性检验采用两独立样本的t检验，多组均数间显著性比较用ANOVA分析，以Plt;0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 培养的大鼠背角小胶质细胞形态学观察 倒置相差显微镜下见原代培养的背角小胶质细胞，胞体较大，可见多个长短不一的纤细突起，呈蜘蛛样。OX-42阳性细胞为小胶质细胞，用免疫化学方法鉴定培养的细胞中OX-42免疫反应阳性率gt;90%，表明培养的小胶质细胞符合实验要求。

注：A：混合培养胶质细胞 B：纯化的小胶质细胞OX-42表达。 图1 小胶质细胞培养形态观察

2.2 2-mesADP对背角小胶质细胞[Ca2+]i 的影响 与静息状态下小胶质细胞荧光强度值相比，0.01 μm 2-mesADP可以诱发小胶质细胞Ca2+荧光强度轻度升高，但不具有统计学意义；0.1～100 μm 2-mesADP可以以剂量依赖的方式诱发小胶质细胞Ca2+荧光强度逐步升高，具有统计学意义(P﹤0.001)； 100 μm 2-mesADP诱发小胶质细胞[Ca2+]i 明显升高，具有统计学意义(P﹤0.001)。

注：***P﹤0.001，与对照组比较。 图2 2-mesADP(0.1～100 μm)促进背角小胶质细胞Ca2+ 荧光强度升高

3 讨论

近来大量研究证明,多种P2Y6受体mRNA,P2Y12受体mRNA,P2Y13mRNA,P2Y14受体mRNA存在于脊髓小胶质细胞，但目前对于P2Y受体如何影响小胶质细胞生理功能目前并清楚。P2Y6受体与配体结合后激活Gq蛋白，进而激活磷脂酶C，催化底物磷脂酰肌醇- 4，5-二磷酸(PIP2)水解生成三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)，IP3动员细胞内Ca2+，产生一系列生物学效应[6]。P2Y12受体、P2Y13受体和P2Y14受体可以激活Gi 蛋白，抑制cAMP的产生[7]。但是Lee 和 Chung 也观察到 ADP激活 P2Y12受体的瞬间细胞内cAMP水平上调并伴有PKA的激活；另外，P2Y12受体激活后也可以通过磷脂酶C途径引起细胞内Ca2+浓度上升，促进PKB磷酸化[8]。在本实验观察到，培养的背角小胶质细胞，P2Y受体激动剂2-mesADP可以诱发背角小胶质细胞剂量依赖性 [Ca2+]i升高，但这种[Ca2+]i升高是源于何种机制，尚有待进一步探讨。在小胶质细胞，[Ca2+]i升高有助于促进小胶质细胞的增殖活化和一些神经活性物质的释放，进而影响小胶质细胞-神经元突触传递。这有可能是P2Y受体参与脊髓平面痛觉中枢敏感化的机制之一。

[1] Tozaki-Saitoh H,Tsuda M,Miyata H,et al.P2Y12 receptors in spinal microglia are required for neuropathic pain after peripheral nerve injury[J].J Neurosci,2008,28:4949-4956.

[2]Cattaneo M.The P2 receptors and congenital platelet function defects[J].Semin Thromb Hemost,2005,31:168-173.

[3]Costanzi S,Mamedova L,Gao Z G,et al.Architecture of P2Y nucleotide receptors: structural comparison based on sequence analysis,mutagenesis,and homology modeling[J].J Med Chem,2004,47:5393-5404.

[4]Kobayashi K,Yamanaka H,Yanamoto F,et al.Multiple P2Y subtypes in spinal microglia are involved in neuropathic pain after peripheral nerve injury[J].Glia,2012,60(10):1529-1539.

[5]闵娅兰,刘晓红,肖智,等.鞘内注射MRS2395对慢性坐骨神经结扎大鼠脊髓背角Iba1表达的影响[J].临床麻醉学杂志，2012,28(11): 81-84.

[6]Tatur S,Groulx N,Orlov S N,et al.Ca2+-dependent ATP release from A549 cells involves synergistic autocrine stimulation by coreleased uridine nucleotides[J].J Physiol,2007,584(Pt 2): 419-435.

[7]Lee S,Chung C Y.Role of VASP phosphorylation for the regulation of microglia chemotaxis via the regulation of focal adhesion formation/maturation[J].Mol Cell Neurosci,2009,42: 382-390.

[8]Irino Y,Nakamura Y,Inoue K,et al.Akt activation is involved in P2Y12receptor-mediated chemotaxis of microglia[J].J Neurosci Res,2008,86:1511-1519.

[收稿2012-11-12;修回2012-12-12]

(编辑：谭秀荣)

P2Yreceptoragonistinducedtheincreaseof[Ca2+]iincultureddorsalhornmicroglialcells

Minyalan,Chengnianqun,Tianhong,Liuaidong,Liuxiaohong,Xiaozhi,Zengjunwei

(Department of Physiology,Zunyi Medical University; Guizhuou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo investigate the effect of 2-mesADP (P2Y receptor agonist) on the change of [Ca2+]i in dorsal horn microglial cells.MethodsThe expression of ox-42 in cultured dorsal horn microglial cells was observed by immunohistochemical staining.2-mesADP-induced Ca2+mobilization in cultured dorsal horn microglia was measured by laser scanning confocal microscopy.ResultsCultured dorsal horn microglial cells expressed high level of ox-42.Furthermore,2-mesADP could induce the increase of the Ca2+fluorescent intensity in microglial cells in a dose-dependent manner.ConclusionP2Y receptor agonists 2-mesADP can induce the increase of [Ca2+]i in dorsal horn microglial cells.

Dorsal horn; microglial cell; P2Y receptor

国家自然科学基金资助项目(NO:31000497);遵义医学院博士科研启动基金项目(NO：2009)。

曾俊伟,女，副教授，研究方向：疼痛生物学机制，E-mail:junweizeng@sohu.com。

R744.5

A

1000-2715(2013)01-0010-03