两种植物不同生理期叶片挥发性成分差异的初步研究

黄 静，李 忠，冯 文，郭生云，施红林

云南烟草科学研究院，昆明 650106

莲雾(Syzygium．Samarangense(Bl.)Merr.et Perry)，桃金娘科蒲桃属的常绿小乔木。又名天桃、辇雾、琏雾、爪哇浦桃。原产于马来半岛，在马来西亚、印尼、菲律宾、台湾、广东、福建南部及广西普遍栽培。性喜温暖怕寒冷，生长最适气温为25～30℃，喜好湿润的肥沃土壤，莲雾性味甘平，功能润肺、止咳、除痰、凉血、收敛［1］。

柚子(Citrus grandis(Linn.)Osbeck)，芸香科柑橘亚科柑橘属常绿果树，花白色，果实大，果味酸，其花、叶、果皮均可提取芳香油。柚子叶具有清新的芳樟醇和乙酸芳樟酯的香气，广泛用于香水、花露水以及化妆品和香皂的加香。我国柚子种植面积很大，南方各省均有大面积种植，但几乎没有进行柚子叶精油的开发利用，造成资源的大量浪费［2］。

植物的叶片是光合作用的场所，也是整株植物生长发育所需营养物质的重要“源库”［3］。植物叶片在不同生理期所累计的各种蛋白质、糖分以及有机物等有很大的区别，不同时期的叶片积累物质由于植物生理需求的不同而产生变化，相应的植物叶片提取物的挥发性成分也发生变化。对莲雾和柚子不同生理期叶片挥发性成分差异的研究国内未见报道。本研究采用高分辨质谱HRMS以及多维数理统计方法对不同时期采集的柚子叶和莲雾叶片的挥发性成分进行分析，多维数据统计利用EZinfo 2.0软件［4］(Umetrics公司)进行处理，其可通过简单的操作界面将复杂数据按规定的方式给出可判断的多元数据分析结果，对实验植物样品生理期的差异对其挥发性成分的影响进行初步探讨。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

仪器:美国Waters公司GCT飞行时间质谱;试剂:二氯甲烷为色谱纯，水为去离子水;材料:阴干的莲雾叶片与柚子叶片，采自西双版纳，品种经由云南热带植物研究所刘昌芬研究院鉴定确认。

1.2 分析条件

质谱参数:接口温度为220℃;离子源温度为220℃;电离方式为EI+;电子能量为70 eV;扫描范围为40～400u。

色谱参数:气相色谱条件。色谱柱为PE-35MS(30 m × 0.32 mm，0.25 μm);进样口温度为250℃;载气为高纯氦气，流速为1.5 mL/min;分流比为20∶1;程序升温:初始温度50℃，维持10 min，然后以10℃/min的速率升至250℃，维持10 min。

1.3 实验方法

样品处理:样品为初生2个月莲雾新叶和柚子新叶，初生8个月的莲雾老叶与柚子老叶;共四个样品，分别在种植基地上经由5个采集点采摘，分别混合均匀，经阴干脱水后，各取20 g样品，用同时蒸馏萃取法提取，溶剂为二氯甲烷，蒸馏产物用定量浓缩仪浓缩至1 mL。

进样方法:共四个样品，每个样品分别连续进样8针。

数据分析方法:进样后，将得到的4组数据(每组8针，共计32个数据)导入分析软件EZinfo2.0，进行多维数据分析。

2 结果与讨论

2.1 4组数据的比较

通过EZinfo2.0软件的EDIT METHOD进行参数设置，对4组样品(每组8针)挥发性成分数据进行PCA-X分析，得到图1。从图中可以看出，4组分析样品挥发性成分之间有显著性差异。初步分析，莲雾叶提取物和柚子叶提取物之间由于植物的不同存在有较大差异，其中，莲雾新叶提取物与莲雾老叶提取物之间的差异较大，而新老柚子叶提取物之间差异较小，初步可以看出生理期对柚子叶挥发性成分的影响比莲雾叶小。

图1 4组分析样品挥发性成分的PCA-X分析Fig.1 The PCA-X score plot of the four samples

表1 4组数据适合度分析的R2与Q2值Table 1 The R2and Q2value of goodness of the model fit

对4组数据-柚子新叶、柚子老叶、莲雾新叶、莲雾老叶进行主成分1、2的适合度分析，得到其R2与Q2值，见表1，可以看出，主成分1、2的对四组数据分组的累计贡献率均大于0.8，其中主成分2对4组样品的差异性的累计贡献率较大。

将四组数据做载荷图分析，载荷图是用来每个变量分子对主成分的贡献，如果Loading值比较大的话，其对主成分贡献就会比较大。分别得到每个变量分子对主成分1、2贡献值数据，其中贡献值大于0.08的变量分子结果见表2、3。可以看出主成分1、2的贡献率较大的变量分子的保留时间集中在12.28 ～ 23.04 min。

图2 4组数据的载荷图分析Fig.2 The loading plot of the developed model with the four samples'data set

表3 变量分子对主成分2的载荷值Table 3 The loading value of variable to principal component 2

2.2 柚子叶与莲雾叶的比较

用EZinfo2.0软件对柚子叶的两组数据与莲雾叶的两组数据进行GROUP DIFFERENCES分析，点击S-PLOT散点图类型，得到图3。可以看出，分组分析后柚子叶提取物与莲雾叶提取物的离子碎片大多是处在不同的区块，在大多数成分上是具有显著性差异的。

图3 柚子叶与莲雾叶碎片离子的S-PLOT图Fig.3 The S-plot of the extract ion fragment between waxapple leaves and pomelo leaves

2.3 新老莲雾叶的比较

从图1中提取莲雾新老叶两组数据进行GROUP DIFFERENCES分析，得到其相关系数图(图4)和S-PLOT图(图5)，从图4中可以看出，图中莲雾老叶的变量分子相较于莲雾新叶相对于Y轴的离散程度大，相关系数图主要看各个变量相对Y轴的离散程度，离散的越远对分组的影响越大。说明莲雾老叶所含变量对莲雾新老叶的分组的影响较大。证明莲雾叶片在不同生理期所表现出的香味风格特点上有明显区别，与人工嗅闻结果一致。结合NIST2008、WILEY谱图库及相关文献，对S-PLOT图中莲雾新老叶片提取物的协方差系数大于0.1(协方差系数=p［1］/p(corr)［1］)的离子碎片进行分析，部分结果见表1和表2。

图4 新老莲雾叶的系数图Fig.4 The coefficients of different period of wax-apple leaves

图5 新老莲雾叶的S-PLOT图Fig.5 The S-plot of different period's wax apples leaves

表4 莲雾老叶较莲雾新叶多的部分化合物Table 4 Additional compounds only detected in wax-apple stale leaves

表5 莲雾新叶较莲雾老叶多的部分化合物Table 5 Additional compounds only detected in wax-apple fresh leaves

根据表4和表5的结果显示，莲雾新老叶片所表现出的香味特征上有较大区别，说明莲雾叶片在生理过程中挥发性成分发生了较大的改变，莲雾老叶较之莲雾新叶多出的物质有α-萜品烯、双戊烯、1，2-二乙苯、1，2，3，4-四甲基苯等，相较于莲雾新叶这些挥发性成分大多会增加加工产品的刺激性，而莲雾新叶的挥发性成分较多且大多为应用于工化工、食品的香料。因此，莲雾叶的采收宜在前期进行。

2.4 新老柚子叶的比较

图6 新老柚子叶的系数图Fig.6 The coefficients of different period of pomelo leaves

用同样处理方法对新老柚子叶提取物挥发性成分数据进行分组对比，同样得到其相关系数图(图6)和S-PLOT图(图7)，从图6中可以看出，柚子新老叶片的变量分子相对于Y轴的离散程度相差不大，说明柚子叶片所含的挥发性成分在其生理过程中没有产生太大的变化，结果与图1的分析结果一致。柚子老叶的变量分子相较于柚子新叶相对于Y轴的离散程度稍大，说明柚子老叶所含变量对柚子新老叶的分组的影响较大。证明柚子叶片在不同生理期的挥发性成分也是有所区别，与人工嗅闻结果一致。

图7 新老柚子叶的S-PLOT图Fig.7 The S-plot of different period's pomelo leave

表6 柚子老叶较柚子新叶多的一些化合物碎片Table 6 Additional fragments information of pomelo stale leaves compared to pomelo fresh leaves

表7 柚子新叶较柚子老叶多的一些化合物碎片Table 7 Additional fragments information of pomelo fresh leaves compared to pomelo stale leaves

从图7可以看出，柚子老叶所含的挥发性分子较之柚子新叶多，结合NIST2008、WILEY谱图库及相关文献，对S-PLOT图中柚子新老叶提取物的协方差系数大于0.1的离子碎片进行检索，部分结果见表6和表7。柚子新叶中的3-蒈烯的含量较老叶子多，另一方面，老叶子显相对于新叶子著性增加的化合物较多，如石竹烯、松油烯、罗汉柏烯等，且这些物质常用于加工或合成食用或日化用香精香料。以上分析结果表明，柚子叶的采收宜在后期，这样有利于柚子叶中挥发性化合物的富集。

3 结论

本研究对不同生理期的莲雾叶片和柚子叶片进行同时蒸馏萃取得到提取物，采用高分辨质谱得到4组天然植物提取物的挥发性成分谱图，通过多维数理统计对谱图数据进行分析，对比研究4组之间碎片离子的差异，从碎片离子的数量和强度来表征样品挥发性成分的差异，并分别对莲雾新老叶提取物与柚子新老叶提取物挥发性成分中协方差系数大于0.1的部分离子碎片进行了定性分析，用数据证明了4组植物样品嗅闻香气风格存在的差异与挥发性成分谱图差异的一致性。根据分析结果可得出，莲雾叶的采摘期宜在前期进行，因莲雾新叶的挥发性成分较多且大多可应用于工化工、食品;而柚子叶适宜采摘期则在后期，有利于柚子叶片中物质的富集;实验结果为不同生理期的柚子叶与莲雾叶作为香原料开发与综合利用提供了数据支撑。

1 He TN(何廷农).Flora Republicae Popularis Sinicae(中国植物志).Beijing:Science Press(科学出版社)，1988.

2 Peng QJ(彭清静)，Peng QZ(彭清忠)，Yang DM(杨冬梅).The technology of extracting volatile oil from pomelo leaf with supercritical carbon dioxide.J JiShou Univ，Nat Sci Ed(吉首大学学报，自科版)，2004，25:76-78.

3 Li QY(李全英).The relationship about the quality of rice with blade carbohydrate content in different period.Agric Sci Technol Comm(农业科技通讯)，2001，3:86-87.

4 Umetrics company.EZinfo Software documentation.Available from:http://www.scientific-computing.com/products/product_details.php?product_id=431.