齐墩果烷及熊果烷型五环三萜抗肝损伤作用及其构效关系研究

宁 娱，张 润，邹子军，孙 洋，陈杰桃，林朝展*，熊天琴，祝晨蔯*

1广州中医药大学临床药理研究所，广州 501045;2广州中医药大学中药学院，广州 510006

齐墩果烷型和熊果烷型五环三萜类化合物是广泛存在于植物中的次生代谢产物，近年来的研究表明，该两类成分具有较好的抗肝损伤活性［1，2］，可通过促进肝细胞再生，使坏死区迅速修复、降低肝组织炎症反应、抑制胶原纤维增生等途径，从而发挥保肝作用。目前已有齐墩果酸、甘草甜素等作为保肝药物在临床上分别用于急性黄疸型肝炎和病毒性肝炎的治疗。因此，植物来源的三萜类化合物在开发保肝新药方面显示了巨大的潜在优势。

已有文献研究报道，紫珠属(Callicarpa)、香茶菜属(Isodon)植物中多含有三萜类成分［3，4］，而本课题组长期对上述2属的3种广东地区习用药材枇杷叶紫珠、裸花紫珠和狭基线纹香茶菜中五环三萜化合物进行系统的分离鉴定研究，得到32个五环三萜类化合物［5，6］，采用葡萄糖氧化酶GO造氧化肝损伤细胞模型，检测五环三萜类单体化合物对肝损伤细胞的保护活性，同时利用目前最常用的3D-QSAR方法——比较分子力场分析(Comparative Molecular Field Analysis，CoMFA)［7，8］研究三萜类化合物分子结构参数与氧化肝损伤细胞保护活性之间的三维定量关系，并建立相应的结构活性关系模型，以期为深入研究其保护机制、设计高活性保肝药提供基础。

1 仪器与材料

熔点用X6显微熔点测定仪测定(北京泰克仪器有限公司);NMR用AVANCE AV 400超导核磁共振仪(瑞士Bruker)测定;TMS内标;MS用Agilent QQQ 1260-6460(液相色谱-质谱联用仪)，Agilent公司(美国)。柱层析硅胶和薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂);所有分离用有机溶剂均为国产分析纯(广州化学试剂厂);反相硅胶:RP-C18(40～63 μm)。氘代试剂:吡啶(NORELL，USA)，甲醇和氯仿(Cambridge Isotope Laboratories，USA)。

实验所用枇杷叶紫珠、裸花紫珠和狭基线纹香茶菜分别采自从化国家森林公园、海南临高裸花紫珠种植基地和清远狭基线纹香茶菜GAP种植基地，经广州中医药大学药用植物学教研室潘超美教授鉴定学名为马鞭草科(Verbenaceae)紫珠属(Callicarpa L.)植物枇杷叶紫珠(C．konchiana Makino)、裸花紫珠(C．nudiflora Hook.et Arn)和唇形科(Labiatae)香茶菜属(Isodon)植物狭基线纹香茶菜(I．lophanthoides var．gerardianus)，凭证标本现保存于广州中医药大学中药学院药物分析研究室(凭证标本:No.CKM071005;CNF081003;ILG080916)，晾干，粉碎成粗粉，备用。

2 提取与分离

取枇杷叶紫珠、裸花紫珠和狭基线纹香茶菜粗粉各10.0 kg，分别用甲醇(150～200 L)进行渗漉提取，将提取液减压浓缩。将浓缩液混悬于6.0～10.0 L蒸馏水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，将萃取液分别进行减压浓缩得到各部位浸膏。每个乙酸乙酯部位运用硅胶柱色谱法进行分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，适当合并为若干个流份。根据流份的具体情况，再选用重结晶、硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱等方法反复分离纯化。分别得到五环三萜化合物1～32，纯度经过HPLC面积归一化法测定，均大于99%。

3 结构鉴定

本研究从枇杷叶紫珠、裸花紫珠和狭基线纹香茶菜三种药用植物中总共分离得到32个三萜类化合物(见表1和表2)，该类成分大部分为三萜苷元，共有25个，只有7个以苷的形式存，分离的三萜类化合物分别属于齐墩果烷型(10个):齐墩果酸(oleanolic aicd，1)、2α，3β，23-三羟基齐墩果烷-12烯-28-酸-O-β-葡萄 糖 酯 (2α，3β，23-trihydroxy-12-ene-28-oic-O-β-D-glucopyranoside，2)、2α，3β-二羟基-12-烯-28-齐墩 果 酸 (2α，3β-dihydroxyolean-12-ene-28-oic acid，3)、2α，3β，23-三羟基-12-烯-28-齐墩果酸(hyptatic acid，4)、2α，3β，19α，23-四羟基-12-烯-28-齐墩果酸(2α，3β，19α，23-tetrahydroxy-12-ene-28-oic-acid，5)、2α，3β，23，29-四羟基-12-烯-28-齐墩果酸(stachlic acid A，6)、常春藤皂苷元(hederagenin，7)、3-乙酰齐墩果酸(3-acetyl oleanolic acid，8)、2α，3β，19α，23-四羟基-12-烯-28-齐墩果酸-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖酯 (2α，3β，19α，23-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-Dglucopyranoside，9)、3-O-β-D-葡萄糖-α-香树脂醇苷(α-amyrin-3-O-β-D-glucopyranosides，10);熊果烷型(22个):3β-乙酰氧基熊果烷-12-烯-28醇(3β-acetoxy-28-hydroxyurs-12-ene，11)、α-香树脂醇乙酸乙酯(α-amyrin acetate，12)、3β-乙酰氧基-12-烯-28 熊果酸(3β-acetoxy-28-oic acid-12-ene，13)、3β，19α-二羟基-12 烯-28 熊果酸(3β，19α-dihydroxyurs-12-ene-28-oic acid，14)、3β，19α-二羟基熊果烷-12 烯-24，28-二 醇 (3β，19α-dihydroxy-24，28-hydroxyurs-urs-12-ene，15)、2α，3β，19α-三羟基熊果烷-12 烯-24，28-二酸(2α，3β，19α-trihydroxy-urs-12-ene-23，28-dioic acid，16)、3-O-β-L-阿拉伯糖-19α-羟基熊果烷-12 烯-28-酸-甲酯(3-O-β-L-arabinopyranosyl-19α-hydroxy-urs-12-ene-28-O-acid methylester，17)、3-O-β-D-木糖-19α-羟基熊果烷-12 烯-28-酸-O-β-D-葡萄糖酯 (3-O-β-D-xylpyranosyl-19α-dihydroxyurs-12-ene-28-O-β-D-glycopranoside，18)、2α，3-O-β-D-葡萄糖醛酸-19α-羟基-12 烯-28-熊果酸(2α，3-O-β-D-glucuronide-19α-dihydroxyurs-12-ene-28-oic acid，19)、3-β-O-α-L-阿拉伯糖-19α-羟基熊果烷-12 烯-28-酸-β-D-葡 萄 糖 酯 (3-β-O-α-L-arabinopyranosyl-19αhydroxy-urs-12-ene-28-β-D-glucopyranoside oic acid，20)、2β，3β，19α-三羟基熊果酸(2β，3β，19α-trihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，21)、熊果酸 (ursolic acid，22)、2α，3β，19，23-四羟基-12 烯-28-熊果酸(myrianthic acid，23)、坡模酸(pomolic acid，24)、2α，19α-二羟基熊果酸(2α，19α-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，25)、2β-羟基熊果酸 (2α-hydroxy-12-ene-28-ursolic acid，26)、3-O-β-D-葡萄糖-α-香树脂醇苷(α-amyrin-3-O-β-D-glucopyranoside，27)、α-香树脂醇(α-amyrin，28)、2α，3α-二羟基熊果酸(2α，3α-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，29)、2α，19α-二羟基熊果酸 (2α，19α-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，30)、2α，3β，19，24-四羟基-12-烯-28-熊果酸(2α，3β，19，24-tetrahydroxy-12-ene-28-oic acid，31)、2α-O-乙酰熊果酸(2α-O-acetyl ursolic acid，32)。

4 三萜类成分体外抗肝损伤活性研究

对上述分离得到的齐墩果烷型及熊果烷型五环三萜成分，采用葡萄糖氧化酶GO体外致肝损伤模型进行保肝作用观察。

根据32个药物的溶解性，选用相应的溶剂，制备成1000 μg/mL的母液，实验时，用含10%胎牛血清的培养液稀释成浓度为 1、10、50、100 μg/mL 的溶液，现用现配。取冻存的L02细胞于37℃水浴锅中快速摇溶，在超净工作台中，移入离心管中，并加入新鲜含10%胎牛血清的RPMI-1640，吹打成细胞悬液，1000 rpm离心3 min，弃上清，细胞沉淀加入新鲜含10%胎牛血清的RPMI-1640，吹打成细胞悬液，接种于培养瓶中，放于5%CO2、湿度95%、37℃条件的培养箱中培养。待细胞达培养瓶底面积分数80% ～90%融合后用PBS洗涤1次，加入0.25%的胰酶适度消化，再加入含10%胎牛血清培养基终止消化，吹打成细胞悬液。1000 rpm离心3 min，弃上清，按1∶3比例传代。正常细胞对照组、正常细胞模型组、0.1%生理盐水溶剂对照组、0.1%生理盐水溶剂模型组、0.1%DMSO溶剂对照组、0.1%DMSO溶剂模型组、32个药物组。每组设6个复孔。培养好的L02细胞，用0.25%的胰酶适度消化，用新鲜含10%胎牛血清的RPMI-1640吹打成单个细胞悬液，调整细胞密度为5×105/mL，接种到96孔培养板中，放置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。24 h之后，吸出旧培养液，加入不含胎牛血清的 RPMI-1640，进行同步化。24 h之后加入相应的各组含药培养液培养。培养12 h后，模型组及药物组加入葡萄糖氧化酶GO(终浓度为100 mU/mL)造成氧化应激模型。于GO作用4 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，继续于培养箱中培养4 h后终止培养。小心吸弃孔内上清液，每孔加入 DMSO 150 μL，振荡10min，溶解结晶物，在酶标仪上490 nm处测定各孔的吸光值(A)。实验数据以均数+标准差(±s)表示，采用SPSS13.0统计分析软件处理，显著性检验采用t检验，P＜0.05时为差异有统计学意义。与正常细胞对照组比较，0.1生理盐水溶剂对照组及0.1 DMSO溶剂对照组的吸光值没有差异。与对照组比较，相应的模型组的吸光值均显著降低(P＜0.01)。与0.1%生理盐水溶剂模型组比较，Urosanetype三萜较Oleane-type三萜的保肝活性明显增强，多羟基取代都使得化合物的保肝活性显著升高。

图1 齐墩果烷母核Fig.1 Chemical structures of Oleane-type triterpenoids

表1 齐墩果烷型三萜类化合物Table 1 Structure，experimental and calculated activity values of Oleane-type triterpenoids

5 OH OH CH2OH CH3 OH CH3 COOH H 1.258 0.099 0.239 -0.140 6 OH OH CH3 CH2OH H CH2OH COOH H 2.365 0.374 0.341 0.033 7 H OH CH2OH CH3 H CH3 COOH H 35.522 1.550 1.646 -0.096 8 H OCOCH3 CH3 CH3 H CH3 COOH H 64.35 1.808 1.798 0.010 9 OH OH CH3 CH2OH OH CH3 COOGlu OH 56.332 1.751 1.675 0.076 10 H O-Glu CH3 CH3 H CH3H H ＞100 2.000 1.992 0.088

图2 熊果烷母核Fig.2 Chemical structures of Urosane-type triterpenoids

表2 熊果烷型三萜类化合物结构、活性数据及预测结果Table 2 Structure，experimental and calculated activity values of Urosane-type triterpenoids

5 三萜类成分三维定量构效关系的研究

本文采用Tripos公司的SYBYL 1.3分子模拟软件包完成所有分子模型构建和统计分析工作。如无特殊说明，所选参数均为默认值。本文研究的32个三萜类化合物的保肝活性数据(IC50)来源于体外保肝实验，见表1，活性数据形式经过负对数变换(pIC50=-lgIC50)，这种变换不影响模型的内在规律。随机选择4个化合物作为测试集，用来检验模型的预测能力，其余化合物为训练集。

第一步，活性构象确定。由于CoMFA研究涉及到化合物分子的三维结构，因此确定活性构象是CoMFA研究的关键步骤。先用sybyl x1.3软件中sketch molecule构建化合物，然后以分子力学程序Minimize进行能量优化，优化过程中采用Powell能量梯度法、Tripos力场、Gasteiger-Hckel电荷，迭代1000次，能量收敛限定为0.005 kj/mol，得到优化分子结构，建立分子库。

第二步，分子叠合。是CoMFA方法中的关键一步，对于所建立的三维构效关系模型质量有重要影响。当活性构象确定后，一般根据一定的规则，如药效团、力场、公共骨架等进行分子叠合，使每个分子采用具有最大力场相似性的空间取向进行计算。本研究选择活性最好的化合物31为模板分子，用A-lign Database进行骨架叠合，见图3。

第三步，CoMFA模型的构建。将重叠好的分子置于自动生成的三维网格中，网格包含所有分子，并且在 X、Y、Z轴方向至少延伸0.4 nm。用一个sp3杂化的正碳原子探测每个格点上的立体场与静电场能，利用偏最小二乘法(PLS)建立模型，首先用SAMPLS方法做LOO(Leave-one-out)交叉验证，得到最佳主成分数和交叉验证系数q2。然后在最佳主成分数下做非交叉验证，建立相应的CoMFA模型。随后，采用SteDev* Coeff方法显示三维等值图，直观地反映出立体场和静电场对活性的影响。

图3 化合物的分子叠合图Fig.3 Superimposition map of compounds

6 结果与讨论

本文以28个化合物为训练集，在自动生成的网格上，以sp3杂化的正碳原子为探针，计算分子在每个格点上的立体场和静电场(相应的立体作用能与静电作用能的阈值均用默认值)，交叉验证相关系数q2为0.719，最佳主成分数为6;由最佳主成分数进行非交叉验证得到常规相关系数γ2为0.976;标准方差(SEE)为0.124，数据组之间的平均平方误差与数据组内部的平均平方误差的比值(F)为142.001，立体场和静电场的贡献值分别为86.7%%和13.3%，表明空间效应是主要的影响因素。一般认为，q2大于0.5时，所得模型具有可信的预报能力，非交叉验证的常规相关系数大于0.9时，表明模型有很好的自身一致性。本模型 q2达到0.719，γ2达到0.976，说明该模型具有较好的预测能力和自身一致性。由CoMFA模型预测的各化合物活性及其与实验值的残差见表1。预测值与实验值的相关分析图见图4。

图4 CoMFA模型预测活性与实验活性之间的关系Fig.4 Predicted and experimental pIC50for the CoMFA model

图5为较为理想的CoMFA模型三维等值图，从叠合分子周围空间可看出化合物的各种不同场对活性的影响。立体场分布图(5A)中，在绿色区域引入大体积取代基或在黄色区域减小取代基的体积有利于化合物活性的提高，静电场分布图(5B)中，在蓝色区域引入正电性基团或在其红色区域引入负点性较大的基团将有利于化合物活性增加，分析可得Urosane-type三萜较Oleane-type三萜的保肝活性明显增强;在3、19、20、23和24等5个取代位置添加带负电荷的基团如-OH，则使化合物的保肝活性明显提高;如在这些位置引入疏水性较强的基团如-CH3等，则可能使化合物的保肝活性降低。在19和23两个位置上接入-OH化合物比其他位置接上-OH的化合物保肝活性明显要好。该结论同药理活性实验结果一致，进一步说明本文所建立的CoMFA模型具有较好的预测能力。

综上所述，本文对32个五环三萜类化合物进行的3D-QSAR研究，构建了一个预测能力较强的CoMFA模型，其交叉验证系数q2为0.719，非交叉验证系数γ2为0.976，统计方差比F=142.001，影响药效立体场的静电场贡献分别为86.7%%和13.3%，表明空间效应是主要的影响因素。以上研究结果说明Urosane-type三萜可以作为保肝药的候选先导化合物，为后续深入进行具有针对性的局部结构改造和优化提供较为理想的模板，有望开发出具有更高保肝活性的化合物。

图5 CoMFA模型等值图Fig.5 Contour maps of the CoMFA model

1 Zhou ZY(周志勇)，Yuan D(袁丁).Progress in studies on pharmacological effect of oleanolic acid.China J Hospit Pharm(中国医院药学杂志)，2008，28:2031-2032.

2 Xiong XJ(熊筱娟)，Chen W(陈武)，Xiao XH(肖小华)，et al．The comparative protective effect of ursolic acid and oleanolic acid on experimental liver injury in mice.J Jiangxi Normal Univ(江西师范大学学报)，2004，28:541-543.

3 Pan P(潘萍)，Sun QS(孙启时).Chemical constituents of Callicarpa macrophylla Vahl..J Shenyang Pharm Univ(沈阳药科大学学报)，2006，23:565-567.

4 Ren FZ(任凤芝)，Qu HH(屈会化)，Luan XH(栾新慧)，et al．Studies on the chemical constituents of Callicarpa bodinieri Levl.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2000，13:33-34.

5 Lin CZ(林朝展)，Zhu CC(祝晨蔯)，Deng GH(邓贵华)，et al．Studies on the chemical constituents of Callicarpa kochiana.J Chin Med Mater(中药材)，2010，33:897-900.

6 Deng JW(邓洁薇)，Zhang CX(张翠仙)，Lin CZ(林朝展)，et al．Analysis of chemical constituents from Isodon lophanthoides var.gerardianus(part I).Tradit Chin Drug Res Clin Pharm(中药新药与临床药理)，2009，20:551-553.

7 Wu XY(伍小云)，Zhang JJ(张嘉杰)，Wu SG(吴曙光).Three dimensional quantitive structure activity relationship of VEGFR-2 tyrosine inhibitors.Acta Sci Nat Univ SunYatSeni(中山大学学报)，2010，49:529.

8 Li JB(李嘉宾)，Xuan WS(宣文胜)，Niu J(牛菊)，et al.Synthesis，biological evaluation and 3D-QSAR study of 1-(1.4-benzodioxan-2-ylcaronyl)-4-aryloxyalkyl-piperazines as α1-adrenoceptor antagonists.J China Pharm Univ(中国药科大学学报)，2010，41:499-504.