巴戟天配伍维生素C对大鼠运动性肾脏缺血再灌注的保护作用

郭爱民，曹建民，周海涛

1中国石油大学(北京)，北京102249;2北京体育大学，北京 100084;3北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023

随着现代中医药理论的发展、现代药理学理论及现代生物技术的更新，更多的单剂或配伍组方应用于体育实践。中药以其多靶点、多途径作用且几乎不含违禁成分的特点日益显示出其独特的优势，在提高运动员身体机能及缓解疲劳方面取得了一定的成就。

机体在稳定状态下，肾血流量可以通过自身调节机制来维持相对恒定。在剧烈运动时，肾血流在神经和体液因素的影响下发生改变。由于各器官血流量重新分配，使活动器官特别是肌肉的血流量增多，肾血流量急剧下降，并伴随运动过程的持续和强度递增表现的更加明显［1］。肾脏的这种不完全缺血状态形成了“运动性肾缺血”。运动停止后，肾血供应恢复形成运动性肾缺血后的“再灌注”［2］。缺血再灌注损伤过程中，自由基的产生异常增多起着重要作用。研究表明，巴戟天具有提高过氧化物歧化酶活性、降低脂质过氧化物的药理作用［3］，维生素C作为体内重要的抗氧化剂，可以有效清除自由基［4］。本文研究巴戟天配伍维生素C对大鼠缺血再灌注肾脏的影响，并探讨二者在缺血再灌注损伤中的作用及其机制，旨在为其临床应用提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 试验动物

清洁级雄性Wistar大鼠100只，42 d龄，平均体重(196.7±12.1)g，北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号SCXK(京)2006-0008。在整个试验过程中，实验室内温度保持在(22±2)℃，相对湿度55%～75%，光照时间随自然变化。所有试验大鼠均以基础饲料(北京大学医学部实验动物科学部提供)和蒸馏水常规饲养，自由饮食。试验时间为63 d，正式训练时间为56 d。

1.2 试验用药

巴戟天(Morindae Officinalis)，产自广东肇庆，北京同仁堂购得，批号:100156357，并经天津中瑞药业有限公司高占友高级工程师鉴定。称取巴戟天50 g加7倍水，浸泡90 min后煎30 min，将所得水煎液过滤，再将过滤出的巴戟天加4倍水，煎30 min，将所得水煎液过滤。将2次过滤出的水煎液混合，浓缩到50 mL置于三角瓶内。最后将制备好的所有药液放入4℃冰箱冷冻保存，即为巴戟天煎剂1 g(生药)/mL。

1.3 试剂

血清肌酐(Cr)采用Jaffe苦味酸法测定，血尿素氮(BUN)采用二乙酰-肟法测定，丙二醛(MDA)采用比色法测定;超氧化物歧化酶(SOD)，采用黄嘌呤氧化酶法测定，均采用南京建成生物工程研究所提供试剂盒，试剂盒编号20120509，并严格按照使用说明操作。

1.4 仪器

BS224S型电子分析天平(德国赛多利斯);光学显微镜(日本OLYMPUS公司);ALCYON300全自动生化分析仪(美国雅培);756M C型紫外-可见分光光度计(上海精密仪器厂);GL-20G高速冷冻离心机(上海安亭)。

2 试验方法

2.1 动物分组

实验大鼠适应性饲养4 d后，以20 min/d的运动量对其进行为期3 d的筛选，淘汰个别不适应游泳训练者，将剩余大鼠以数字随机分组法分6组:对照组(C组)12只，一般训练组(M组)12只，过度训练组(OM组)24只，巴戟天+过度训练组(MOM组)16只，维生素C+过度训练组(VCOM组)16只，巴戟天+维生素C+过度训练组(MVCOM组)16只进行56 d的游泳训练。训练期间，MOM组、MVCOM组采用专业灌胃器灌胃(ig)，每天一次，剂量为1 g/kg，ig体积为5 mL/kg;VCOM组、MVCOM组采用腹腔注射(ip)，剂量为100 mg/kg，每天一次，注射体积为0.5 mL(通过预实验获得最佳剂量)，其他各组ig等量生理盐水。

2.2 实验方法。

2.2.1 训练及测试方案

C组常规饲养，不加任何干预，平时不运动。M组进行中等强度游泳训练，正式游泳训练8周。每周训练6 d，每天训练1次，第一次下水游20 min，此后逐渐增加，至第1周末时每天游60 min，第2周末时加至每天游90 min，第3周末时加至每天游120 min，此后5周均保持此运动量。其他各组前3周训练安排同M组，第4周起开始安排高强度训练。大鼠进行负重游泳，每次训练至力竭。力竭标准以大鼠下沉后10 s不露出水面为度。第1～3周负0.5%体重，第4周负1%体重，第5周负2%体重，每天训练1次。第6周每天上、下午各训练1次，第7～8周，每天上、下午、夜间各训练1次，均负5%体重。至第8周末，C、M组大鼠，均正常生长，无意外死亡发生。其他各组大鼠因尾部负重，疲劳衰竭不能恢复及训练意外死亡等原因，死亡率较高。OM组、MOM组、VCOM组、MVCOM 组分别剩余14、12、11、13只。各组分别取10只用于实验取材，其他随机剔除。

2.2.2 指标测定

各组大鼠于末次游泳训练24 h后，乙醚适度麻醉，从颈总动脉处取血加入柠檬酸钠溶液抗凝，37℃水浴中30 min后，4℃ 3000 rpm离心10 min，分离制备血清，置-20℃冰箱中保存待查。迅速取双肾，剔除筋膜，置于预冷的生理盐水中洗净血污，肉眼观察肾脏大小，色泽、质地。分离左肾，取肾上极组织0.5 g，用1.5 mL生理盐水在1℃下以12000 r/min研磨制成10%肾组织匀浆;10%甲醛固定肾组织标本，石蜡包埋，制成4 μm厚切片，HE染色，观察组织病理学变化。

2.3 数据统计

采用SPSS12.0软件对所有数据进行处理，数据用平均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为有统计学意义。

3 试验结果

3.1 运动及巴戟天、维生素C对大鼠肾组织的病理改变

Scr和BUN测定后取各组肾组织制作石蜡切片，进行HE染色，光镜下观察组织形态学变化，肾脏病理变化评价参照Pallers标准［5］，在400倍光镜下随机选5个视野，每个视野选10个肾小管评分。1、肾小管明显扩张，细胞扁平为1分;2、刷状缘损伤为1分，脱落为2分;3、细胞膜大泡1分，细胞浆空泡1分;4、间质水肿1分;5、肾小管腔内有脱落的坏死细胞未形成管型或碎片为1分，形成管型或碎片为2分。肾小管评分由两名技术员双盲计算，取其平均值。光镜下静止对照组、一般训练组大鼠肾组织结构正常，无淤血、变性和水肿，肾小管管腔内无管型。过度训练组大鼠肾小球有淤血现象，小管上皮细胞水肿、空泡变性、管腔扩张，管腔中有少量的脱落绒毛和上皮细胞，以及各种管型。其他各组组织病理学改变较过度训练组轻，有轻微的小管上皮细胞水肿、空泡变性，管腔扩张现象，无蛋白管型和细胞管型。各组大鼠肾小管Paller［5］评分，静止对照组、一般训练组组间无显著差异(P＞0.05)，静止对照组、一般训练组明显低于其他组(P＜0.01)，治疗组显著低于过度训练组大鼠(P＜0.05)，且均未见肾小球明显病理改变。

表1 各组大鼠肾小管损害评分比较(n=10，±s)Table 1 Tubular damage score in various groups of rats(n=10，±s)

表1 各组大鼠肾小管损害评分比较(n=10，±s)Table 1 Tubular damage score in various groups of rats(n=10，±s)

注:与C组比较，1)表示P＜0.05，2)表示P＜0.01;与OM组比较，3)表示 P ＜0.05，4)表示 P ＜0.01。Note:compared with C group，1)and2)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively;compared with OM group，3)and4)represent P ＜0.05 and P＜0.01，respectively.

组别Groups肾小管损害评分Tubular damage score(scores/HP)C group 2.49±1.75 M group 2.88±1.524)OM group 12.86±1.892)MOM group 10.24 ± 1.482，3)VCOM group 10.98 ± 1.252，3)MVCOM group 9.53 ± 1.652，3)

3.2 运动及巴戟天、维生素C对大鼠血清BUN和SCr的影响

表2 各组大鼠血清尿素氮和肌酐含量比较(n=10，±s)Table 2 Blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(SCr)levels in plasma of different groups(n=10，±s)

表2 各组大鼠血清尿素氮和肌酐含量比较(n=10，±s)Table 2 Blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(SCr)levels in plasma of different groups(n=10，±s)

注:与C组比较，1)表示P＜0.05，2)表示P＜0.01;与OM组比较，3)表示P ＜0.05，4)表示P ＜0.01;与VCOM 组比较，5)表示P ＜0.05，6)表示P＜0.01。Note:compared with C group，1)and2)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively;compared with OM group，3)and4)represent P ＜0.05 and P＜0.01，respectively;compared with VOCM group，5)and6)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively.

组别Groups血清尿素氮BUN(mmol/L)血清肌酐SCr(μmol/L)C group 8.28±1.14 30.74±9.83 M group 9.05 ± 1.031，4) 36.29 ± 9.371，4)OM group 15.02±1.142) 79.54±10.342)MOM group 10.54 ± 1.232，3，5) 65.08 ± 9.852，3，5)VCOM group 11.45 ± 1.332，3) 69.75 ± 13.042，3)MVCOM group 10.53 ± 1.071，4，6) 56.09 ± 12.451，4，6)

由表2可知:血尿素氮和血清肌酐各组较对照组明显上升，与OM组相比MOM组、VCOM组、MVCOM组明显下降(分别为 P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01);与VCOM组相比，MOM组、MVCOM组明显下降(分别为 P＜0.05，P＜0.01)。

3.3 运动及巴戟天、维生素C对大鼠肾组织匀浆中SOD活性和MDA含量的影响

表3 各组大鼠肾组织匀浆中SOD活性和MDA含量比较(n=10，±s)Table 3 Comparison of SOD activity and MDA content in rat kidney homogenate of each group(n=10，±s)

表3 各组大鼠肾组织匀浆中SOD活性和MDA含量比较(n=10，±s)Table 3 Comparison of SOD activity and MDA content in rat kidney homogenate of each group(n=10，±s)

注:与C组比较，1)表示P＜0.05，2)表示P＜0.01;与OM组比较，3)表示P ＜0.05，4)表示P ＜0.01;与VCOM 组比较，5)表示P ＜0.05，6)表示P＜0.01。Note:compared with C group，1)and2)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively;compared with OM group，3)and4)represent P ＜0.05 and P＜0.01，respectively;compared with VOCM group，5)and6)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively.

组别Groups超氧化物歧化酶SOD(U/mgprotmol)丙二醛MDA(U/mgprotmol)C group 105.15±3.27 10.09±1.48 M group 93.33 ± 2.652，3) 17.04 ± 1.622，3)OM group 75.22±1.142) 30.54±1.582)MOM group 84.64 ± 1.532，3，5) 21.08 ± 1.552，3，5)VCOM group 80.19 ± 1.292，3) 25.45 ± 1.442，3)MVCOM group 90.47 ± 1.561，4，6) 15.99 ± 1.351，4，6)

由表3可知:SOD活性各组较对照组明显降低，与OM组相比MOM组、VCOM组、MVCOM组明显上升(分别为 P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01);与VCOM组相比，MOM组、MVCOM组明显上升(分别为P＜0.05、P＜0.01)。MDA含量各组较对照组明显升高，与OM组相比MOM组、VCOM组、MVCOM组明显下降(分别为P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01);与VCOM组相比，MOM组、MVCOM组明显降低(分别为 P＜0.05、P＜0.01)。

4 讨论

肾缺血再灌注(Ischemic reperfusion，I/R)损伤是一个复杂的病理生理变化过程，其具体机制尚未完全阐明。但氧自由基(Oxygen free radicals，OFR)在I/R发生、发展过程中起着至关重要的作用［6］。正常情况下，体内可产生少量自由基，但由于体内具有灭活自由基酶系统，自由基被迅速清除，不产生损伤作用。运动时由于I/R使自由基产生增加，可引发膜脂质过氧化反应，导致膜的液态性、流动性及通透性改变，进而造成膜功能障碍，尤其是线粒体膜的破坏将影响细胞的代谢和机能，并干扰整个器官的生理功能。机体内存在清除自由基、减轻其危害的主要物质是抗氧化酶。SOD是需氧生物体内数千种酶中以氧自由基为底物的唯一酶。其通过催化超氧阴离子形成过氧化氢而清除超氧阴离子，保护机体免受损伤，同时在一定范围内，自由基代谢增强时，SOD会代偿性增加。因此SOD活性的高低是机体抗氧化能力强弱的标志。MDA是细胞脂质过氧化的一种主产物。组织线粒体MDA含量是目前公认的衡量机体自由基代谢的敏感指标［7］。肌酐和尿素氮分别是肌肉和蛋白质的分解代谢产物，主要经血循环从肾脏排除体外，其血中的浓度取决于肾小球滤过能力，当肾脏实质受到损伤，肾小球滤过率降到临界点后，二者的浓度就会明显上升［8］。

实验结果显示，8周的过度训练导致大鼠肾组织组织病理学发生明显改变;血尿素氮、血清肌酐增高［过度训练组(P＜0.01)、巴戟天+过度训练组(P＜0.01)、维生素C+过度训练组(P＜0.01)、巴戟天+维生素C+过度训练组(P＜0.05)高于静止对照组］;SOD活性降低［过度训练组(P＜0.01)、巴戟天+过度训练组(P＜0.01)、维生素C+过度训练组(P＜0.01)、巴戟天+维生素C+过度训练组(P＜0.05)低于静止对照组］;MDA含量升高［一般训练组(P＜0.05)、过度训练组(P＜0.01)、巴戟天+过度训练组(P＜0.01)、维生素C+过度训练组(P＜0.01)、巴戟天+维生素C+过度训练组(P＜0.05)高于静止对照组］。说明过度训练已造成大鼠肾脏运动性缺血“再灌注”损伤，肾功能受到严重损坏。但肾组织组织病理学改变巴戟天+过度训练组、维生素C+过度训练组、巴戟天+维生素C+过度训练组(P＜0.05)较过度训练组明显减轻。血尿素氮和血清肌酐含量巴戟天+过度训练组(P＜0.05)、维生素C+过度训练组(P＜0.05)、巴戟天+维生素C+过度训练组(P＜0.01)低于过度训练组;SOD活性，巴戟天+过度训练组(P＜0.05)、维生素C+过度训练组(P＜0.05)、巴戟天+维生素C+过度训练组(P＜0.01)高于过度训练组;MDA含量，巴戟天+过度训练组(P＜0.05)、维生素C+过度训练组(P＜0.05)、巴戟天+维生素C+过度训练组(P＜0.01)低于过度训练组。表明，巴戟天及维生素C可以有效清除自由基，减轻肾脏的缺血缺氧，抑制脂质过氧化作用，提高SOD活性。有效减轻肾脏缺血再灌注损伤，起到保护作用。其机制可能为:1、巴戟天中的主要成分巴戟天多糖对物理的、化学的及生物来源的多种活性氧(ROS)具有清除作用，能减轻脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的生成量，提高超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和稳定细胞膜的作用，从而促进大鼠运动缺血再灌注损伤［9］;2、巴戟天中富含Vc及Mn等多种微量元素，可以通过减少机体超氧阴离子自由基的生成，而使SOD的消耗相应降低［3］。二方面的联合作用对清除机体自由基、减轻自由基对线粒体膜和肌浆网膜造成损伤起到积极作用;3、维生素C是重要的抗氧化维生素，作为强抗氧化剂可有效清除氧自由基、抑制凋亡级联的启动而减轻细胞、器官的缺血再灌注损伤［10］。此外，3个治疗组间比较，血尿素氮、血清肌酐、MDA含量，巴戟天+过度训练组(P＜0.05)，巴戟天+维生素C+过度训练组(P＜0.01)低于维生素C+过度训练组;SOD活性，巴戟天+过度训练组(P＜0.05)，巴戟天+维生素C+过度训练组(P＜0.01)高于维生素C+过度训练组。提示巴戟天对缺血再灌注损伤肾脏的疗效可能优于维生素C;而二者配伍使用可使血尿素氮，血清肌酐水平含量低于单纯使用巴戟天，使SOD活力增高，提示二者配伍使用可能更有利于缺血再灌注损伤肾脏的保护。

综上所述，巴戟天和维生素C均对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用，可能是通过增强超氧化物歧化酶活性，清除自由基，减轻脂质过氧化作用，进而改善肾脏功能。就疗效而言，二者配伍使用优于二者单独应用，而巴戟天又优于维生素C，但也可能和二者在应用中的剂量大小有关，其剂量和疗效之间的关系，还有待进一步研究。

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