肉桂水溶性部位中一个新的顺式肉桂酸苷衍生物

罗 奇，程 霞，晏永明，程永现，*

1大理学院药学与化学学院，大理 671002;2中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，昆明 650204

肉桂(Cinnamomum cassia)为樟科(Lauraceae)樟属植物肉桂的干皮，是常用温里中药，具有芳香开窍、祛风健胃、抗溃疡、强心、镇静、镇痛、解热、抗惊厥、抑制血小板聚集和抗病原体等作用［1］。近年，随着中医温阳学术思想倍受推崇，温性中药肉桂的临床应用也在增加。肉桂也是一种常用的辛香调料，用于煮肉和制作多种食品，在美国，作为调味品的肉桂其销量已占据第二重要位置。我们关注糖尿病肾病，并从糖尿病肾病属于微血管病变的病理认为温性中药可能对其防治是有效的，为此，我们对肉桂中成分及其抗糖尿病肾病作用进行了研究。采用各种柱色谱从其80%乙醇提取物的水溶性部位分离得到10个化合物，除化合物3、6和10外，其它化合物均系首次从该种中首次分离。

1 仪器与材料

JASCO-20C型数字式旋光仪(日本);VG AUTO Spec-3000(英国 VG公司)及Finnigan MAT 90质谱仪(德国 Finnigan公司);Bruker AM-400、DRX-500及Avance III 600 MHz核磁共振仪(TMS作为内标，δ为ppm，J为Hz);200～300目柱色谱用硅胶和GF254薄层色谱用硅胶(青岛海洋化工厂);45～75 μm MCI gel CHP 20P(日本三菱公司产品);25～100 μm Sephadex LH-20(Pharmacia公司);40 ～63 μm RP-18(日本 Daiso);Agilent RP-18 HPLC色谱柱(9.4 mm × 250 mm，5 μm);Agilent RP-18 HPLC 色谱柱(6 mm × 150 mm，5 μm)。氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有机溶剂均为工业纯经重蒸后使用，去离子水，异丙醇(分析纯)。

肉桂样品于2010年7月购自云南向辉生物科技有限公司，由向辉生物科技有限公司谢福寿工程师鉴定。标本(CHYX0173)存于中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室。

2 提取与分离

干燥肉桂50 kg，粉碎，80%乙醇160 L冷浸动态提取3次，过滤，减压回收乙醇得浸膏(I)7.5 kg。随后将浸膏(I)用丙酮溶解，过滤，减压回收丙酮得浸膏(II)5.0 kg。浸膏(II)加水悬浮后依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，浓缩水层得到1.5 kg，通过类似切割柱的方法(20 ×120 cm，7.5 kg，硅胶200～300 目)，以氯仿-甲醇-水(80∶20∶2.5，25 L，v/v)洗脱划分三段(Fr.1～Fr.3)。各组份经MCI gel CHP 20P、Sephadex LH-20(甲醇)、RP-18 反复柱层析，反相HPLC，结合制备TLC从Fr.1中获得3(1.4 mg)、4(1.3 mg);Fr.2 中获得 6(4.7 mg)、7(2.0 mg)、8(1.5 mg)和9(1.8 mg);Fr.3中获得1(3.2 mg)、2(1.7 mg)、5(4.1 mg)和10(2.2 mg)。

3 结构鉴定

Cassoside I(1)无色油状物。［α］25D:-43.0(c 1.6，MeOH);UV(MeOH)λmax(logε):315(3.94)，292(3.95)，202(4.05)nm;EI-MS:m/z 370［M］+;HREI-MS:m/z 370.1229［M］+(calcd for C17H22O9，370.1264);1H NMR(600 MHz，CD3OD) δ:7.77(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，7.13(1H，overlapped，H-5)，7.17(1H，overlapped，H-6)，6.91(1H，d，J=12.9 Hz，H-7)，5.88(1H，d，J=12.9 Hz，H-8)，4.97(1H，d，J=7.4 Hz，H-1')，3.53(1H，overlapped，H-2')，3.48(1H，overlapped，H-3')，3.41-3.43(2H，overlapped，H-4'，H-5')，3.88(1H，overlapped，H-6'a)，3.69(1H，dd，J=12.0 Hz，5.5 Hz，H-6'b)，3.88(3H，overlapped，-OCH3)，3.72(3H，s，-COOCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:130.8(C-1)，115.3(C-2)，150.1(C-3)，149.0(C-4)，116.4(C-5)，125.8(C-6)，144.6(C-7)，118.1(C-8)，168.5(C-9)，102.1(C-1')，74.7(C-2')，78.2(C-3')，71.2(C-4')，77.8(C-5')，62.4(C-6')，56.6(-OCH3)，52.1(-COOCH3)。

化合物1中混有化合物2，利用反相HPLC纯化化合物1后，在进行核磁共振测试时，发现化合物1中含有化合物2，其比例接近2∶1，据此推测化合物2很可能是化合物1不稳定造成的。从1H NMR和13C NMR谱可以看出信号成对存在。化合物2的1H NMR 给出7.64(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)和6.42(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，表明存在反式双键结构。主要含有化合物1的样品的1H NMR谱给出6.91(1H，d，J=12.9 Hz，H-7)和 5.88(1H，d，J=12.9 Hz，H-8)，表明化合物1中存在顺式双键结构，其它数据与化合物2基本一致，因此化合物1可被鉴定为Glucosyl methyl ferulate(2)的顺式异构体，该化合物为新化合物，命名为Cassoside I。化合物1的主要HMBC和COSY相关见图1，化合物1与2的HPLC图谱见图2。

图1 化合物1的主要COSY及HMBC相关Fig.1 Key HMBC and COSY correlations of compound 1

图2 化合物1(A)、化合物1核磁样品(B)及化合物2(C)的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of purified compound 1(A)，compound 1 degraded sample(B)and purified compound 2(C)

Glucosyl methyl ferulate(2)无色油状物。［α］:-59.5(c 1.5，MeOH);UV(MeOH)λmax(logε):315(4.01)，293(4.03)，202(4.10)nm;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.22(1H，d，J=1.3 Hz，H-2)，7.13(1H，overlapped，H-5)，7.17(1H，overlapped，H-6)，7.64(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，6.42(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，4.97(1H，d，J=7.4 Hz，H-1')，3.53(1H，dd，J=8.9，7.4 Hz，H-2')，3.48(1H，dd，J=8.9，8.9 Hz，H-3')，3.41-3.43(2H，overlapped，H-4'，H-5')，3.89(1H，dd，J=12.0 Hz，2.0 Hz，H-6'a)，3.70(1H，dd，J=12.0，5.5 Hz，H-6'b)，3.90(3H，s，-OCH3)，3.78(3H，s，-COOCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:130.4(C-1)，112.4(C-2)，150.8(C-3)，49.9(C-4)，117.3(C-5)，123.4(C-6)，145.9(C-7)，117.1(C-8)，169.2(C-9)，102.1(C-1')，74.7(C-2')，78.2(C-3')，71.2(C-4')，77.8(C-5')，62.4(C-6')，56.6(-OCH3)，52.1(-COOCH3)。以上数据与文献数值相符［2］。

Caffeine(3)白色粉末。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:3.35(3H，s，N1-CH3)，3.53(3H，s，N3-CH3)，3.98(3H，s，N7-CH3)，7.87(1H，s，H-8);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:28.3(N1-CH3)，156.8(C-2)，30.2(N3-CH3)，150.0(C-4)，109.0(C-5)，153.4(C-6)，34.1(N7-CH3)，144.1(C-8)。以上数据与文献数值相符［3］。

3-Hydroxy-4-methoxy-phenylethanol(4)淡黄色油状物。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:6.73(1H，d，J=1.7 Hz，H-2)，6.63(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.57(1H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-6)，2.66(2H，t，J=7.2 Hz，H-7)，3.63(2H，t，J=7.2 Hz，H-8)，3.28(3H，s，-OCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:131.7(C-1)，116.0(C-2)，145.8(C-3)，148.8(C-4)，113.5(C-5)，122.3(C-6)，39.8(C-7)，64.5(C-8)。以上数据与文献数值相符［4］。

Glycerol-2-(3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid)ether(5)无色针晶。1H NMR(600 MHz，Pyr-d5)δ:7.75(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，7.44(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.84(1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6)，6.89(2H，brs，2(OH)，4.40(2H，dd，J=10.6，5.5 Hz，H-1'a，H-3'a)，4.36(2H，dd，J=10.6，5.5 Hz，H-1'b，H-3'b)，5.07(1H，m，H-2')，3.69(3H，s，-OCH3);13C NMR(150 MHz，Pyr-d5)δ:123.2(C-1，C-6)，113.5(C-2)，149.8(C-3)，153.5(C-4)，114.7(C-5)，167.3(-COOH)，62.0(C-1'，C-3')，82.6(C-2')，55.9(-OCH3)。以上数据与文献数值相符［5］。

Cinnacaside(6)淡黄色油状物。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ:4.04(1H，d，J=10.2 Hz，H-1)，1.76-1.80(1H，m，H-2)，1.53-1.59(2H，m，H-3)，1.51-1.55(2H，m，H-4)，2.45(2H，d，J=3.3 Hz，H-10)，2.66(1H，d，J=12.7 Hz，H-14a)，2.18(1H，d，J=12.7 Hz，H-14b)，1.09(3H，d，J=6.3 Hz，H-15)，1.04(3H，s，H-16)，1.78(3H，s，H-17)，2.88-2.92(1H，m，H-18)，3.86(1H，overlapped，H-19a)，3.44-3.48(1H，t，J=9.0 Hz，H-19b)，0.95(3H，d，J=6.9 Hz，H-20)，4.24(1H，d，J=7.8 Hz，H-1')，3.14-3.19(1H，m，H-2')，3.25-3.36(1H，overlapped，H-3')，3.25-3.36(1H，overlapped，H-4')，3.25-3.36(1H，overlapped，H-5')，3.66(1H，dd，J=3.6，11.7 Hz，H-6'a)，3.86(1H，m，H-6'b);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ:72.9(C-1)，35.1(C-2)，28.9(C-3)，26.5(C-4)，84.6(C-5)，93.0(C-6)，96.9(C-7)，89.3(C-8)，48.3(C-9)，40.8(C-10)，171.7(C-11)，137.3(C-12)，143.1(C-13)，37.2(C-14)，18.9(C-15)，13.7(C-16)，12.3(C-17)，34.4(C-18)，73.7(C-19)，14.9(C-20)，104.5(C-1')，75.2(C-2')，78.0(C-3')，71.7(C-4')，78.1(C-5')，62.8(C-6')。以上数据与文献数值相符［6］。

阿魏酸甲酯(7)白色粉末。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.09(1H，s，H-2)，6.98(1H，dd，J=8.1，1.6 Hz，H-5)，6.68(1H，dd，J=8.1，1.6 Hz，H-6)，7.53(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，6.26(1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，3.80(3H，s，-OCH3)，3.68(3H，s，-OCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:126.8(C-1)，124.4(C-2)，152.0(C-3)，149.7(C-4)，116.7(C-5)，114.4(C-6)，147.1(C-7)，111.3(C-8)，169.9(C-9)，56.3(-OCH3)，51.9(-OCH3)。以上数据与文献数值相符［7］。

Methyl p-hydroxy-trans-cinnamate(8)白色粉末。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.36(2H，d，J=9.1 Hz，H-2，H-6)，6.70(2H，d，J=9.1 Hz，H-3，H-5)，7.53(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，6.23(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，3.68(3H，s，-OCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:126.5(C-1)，131.2(C-2，C-6)，117.4(C-3，C-5)，162.3(C-4)，146.7(C-7)，114.3(C-8)，169.8(C-9)，51.9(-OCH3)。以上数据与文献数值相符［8］。

Methyl p-hydroxy-cis-cinnamate(9)白色粉末。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.56(2H，d，J=9.1 Hz，H-2，H-6)，6.66(2H，d，J=9.1 Hz，H-3，H-5)，6.77(1H，d，J=12.8 Hz，H-7)，5.68(1H，d，J=12.8 Hz，H-8)，3.62(3H，s，-OCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:127.1(C-1)，133.7(C-2，C-6)，116.1(C-3，C-5)，161.1(C-4)，145.3(C-7)，115.6(C-8)，169.6(C-9)，51.9(-OCH3)。化合物 8的1H NMR 信号中，7.53(1H，d，J=16.0 Hz，H-3)和6.23(1H，d，J=16.0 Hz，H-2)为反式偶合烯氢质子信号。化合物9的1H NMR信号中，6.77(1H，d，J=12.8 Hz，H-3)和5.68(1H，d，J=12.8 Hz，H-2)为典型的顺式偶合烯氢质子信号，13C NMR信号与化合物8基本一致。故鉴定化合物9为Methyl p-hydroxy-cis-cinnamate［9，10］。

(+)-Lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside(10)淡黄色油状物。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:2.65(1H，dd，J=14.9，5.4 Hz，H-1a)，2.55(1H，dd，J=14.9，5.4 Hz，H-1b)，1.69-1.59(1H，m，H-2)，2.04-1.96(1H，m，H-3)，3.83(1H，dd，J=9.8，5.4Hz，H-4)，6.51(1H，s，H-8)，6.36(2H，s，H-2'，H-6')，4.35(1H，d，J=6.6 Hz，H-2a)，4.21(1H，d，J=6.6 Hz，H-2b)，3.48(1H，dd，J=10.9，6.6 Hz，H-3a)，3.38(1H，dd，J=10.9，6.6 Hz，H-3b)，3.79(3H，s，OCH3)，3.68(6H，s，2 × OCH3)，3.26(3H，s，OCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:33.9(C-1)，40.5(C-2)，66.2(C-2a)，46.7(C-3)，71.4(C-3a)，42.8(C-4)，148.6(C-5)，138.9(C-6)，147.6(C-7)，107.8(C-8)，130.2(C-9)，126.4(C-10)，139.4(C-1')，106.8(C-2')，149.0(C-3')，134.4(C-4')，149.0(C-5')，106.8(C-6')，104.9(C-1”)，75.2(C-2”)，78.0(C-3”)，71.7(C-4”)，78.2(C-5”)，62.8(C-6”)，60.3(5-OCH3)，56.5(7-OCH3)，56.8(3'-OCH3)，56.8(5'-OCH3)。以上数据与文献数值相符［11］。

4 活性测试

肉桂为温里中药，依据中医理论其可能对糖尿病肾病具有干预作用。为此本实验对所有分离的化合物进行了抗糖尿病肾病活性测试。高糖诱导的肾系膜细胞可分泌促炎性因子和细胞外基质等，类似临床糖尿病肾病病理，因此被认为是研究抗糖尿病肾病的常用模型。采用文献报道的ELISA法测定大鼠肾系膜细胞(HBZY-1)培养上清中的IL-6、fibronectin 及 collagen IV 表达水平［12，13］。用纯化的抗IL-6、fibronectin及collagen IV抗体包被微孔板，制成固相抗体，向包被单抗的微孔中依次加入含表达IL-6、fibronectin及collagen IV的待测样品，再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 IL-6、fibronectin及collagen IV的表达呈正相关。用酶标仪450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中大鼠 IL-6、fibronectin及collagen IV浓度。遗憾的是，结果表明这些成分对上述细胞因子和细胞外基质均未显示明显的活性，是否肉桂中其它成分具有抗糖尿病肾病作用有待进一步研究。

致谢:中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室分析中心测试所有图谱。

1 Liu JY(刘江云)，Yang SL(杨世林)，Xu LZ(徐丽珍).Chemical and pharmacological studies profile of Cinnamomum plant.Int J Tradit Chin Med(国际中医中药杂志)，2001，23:7-12.

2 Shimomura H，Sashida Y，Mimaki Y，et al.Studies on the chemical constituents of Lilium henryi Baker.Chem Pharm Bull，1988，36:2430-2446.

3 Sitkowski J，Stefaniak L，Nicol L，et al．Complete assignments of the1H，13C and15N NMR spectra of caffeine.Spectrochim Acta 1995，51:839-841.

4 Zhang X(张雪)，Gao H(高昊)，Wang NL(王乃利)，et al.Phenolic components from Dendrobium nobile.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2006，37:652-655.

5 Shao JC(邵加春)，He CH(何翠红)，Lei T(雷婷)，et al.Chemical constituents of Tetrastigma planicaule(Hook.)Gagnep.Chin Pharm J(中国药学杂志)，2010，45:1615-1617.

6 Ngoc TM，Ha DT，Lee IS，et al.Two new diterpenes from the twigs of Cinnamomum cassia.Helv Chim Acta，2009，92:2058-2062.

7 Chen W(陈雯)，Tang SA(唐生安)，Qin N(秦楠)，et al.Antioxidant constituents from Smilax riparia．Chin J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2012，37:806-810.

8 Wei JX(魏金霞)，Li DY(李丹毅)，Hua HM(华会明)，et al.Isolation and identification of chemical constituents from flowers of Trollius chinensis(II).J Shenyang Pharm Univ(沈阳药科大学学报)，2012，29:12-15.

9 Danylec B，Iskander MN.1H NMR measurement of the transcis photoisomerization of cinnamic acid derivatives.J Chem Edu，2002，79:1000-1001.

10 Imashiro R，Seki M.A catalytic asymmetric synthesis of chiral glycidic acid derivatives through chiral dioxirane-mediated catalytic asymmetric epoxidation of cinnamic acid derivatives.J Org Chem，2004，69:4216-4226.

11 Achenbach H，Lowel M，Waibel R，et al.New lignan glucosides from Stemmadenia minima.Planta Med，1992:270-272.

12 Min DQ，Lyons JG，Bonner J，et al.Mesangial cell-derived factors alter monocyte activation and function through inflammatory pathways:possible pathogenic role in diabetic nephropathy.Am J Physiol Renal Physiol，2009，297:F1229-F1237.

13 Xia L，Wang H，Goldverg HJ，et al.Mesangial cell NADPH oxidase upregulation in high glucose is protein kinase C dependent and required for collagen IV expression.Am J Physiol Renal Physiol，2006，290:F345-F356.