芹菜素对小鼠血清性激素和精子活动度影响的剂量效应研究

汪燕妮，党瑜慧，刘佳微，吴 双，刘玲飞，李芝兰

兰州大学公共卫生学院，甘肃 730000

目前，绝大多数的避孕措施都主要以女性使用为主，特别是避孕药物的使用。到目前为止，我国国内尚未见到一种效果好、低副作用、被广泛认可的男性避孕药物。芹菜素作为一种天然存在的植物黄酮，广泛存在于各类水果、蔬菜和豆类中，特别是芹菜中含量最为丰富。研究证明具有抗氧化功能、抑制致癌物质、抗炎等多种生物学和药理学作用［1-3］。

有研究显示健康成年男性每日摄食芹菜75 g，连续1～2周后，精子数量会明显减少到难以受孕的程度，这种情况在停食芹菜后几个月又会恢复正常［4］。但具体是芹菜中哪种成分在起关键作用尚未定论。本研究通过观察芹菜素对成年雄性小鼠的血清睾酮(Testosterone，T)、雌二醇(Estradiol，E2)、雌二醇/睾酮(E2/T)以及精子密度和活动率的影响，探讨芹菜素对生殖功能影响的机制，对进一步研究开发芹菜素的药用价值提供一定的线索。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康SPF级昆明种雄性小鼠120只，体重(28.20±3.55)g，周龄6～8周(甘肃中医学院提供)，动物合格证号:SCXK(甘)2011-0001-0001067，实验室设施使用证明号:SCXK(甘)2011-0001-0002756。

每天定时给予对照组0.01 mL/g bw生理盐水灌胃，实验组给予0.01 mL/g bw不同剂量(低剂量组252 mg/L，中剂量组504 mg/L，高剂量组1008 mg/L)的芹菜素混悬液灌胃。连续灌胃 7、14、21 d后分批内眦静脉丛取血后脱臼处死小鼠，分离附睾、睾丸，分别称重，计算脏器系数(脏器系数=脏器湿重/动物体重)。

1.2 仪器与材料

WLJY-9000型伟力彩色精子质量检测系统(北京伟力新世纪科技发展有限公司);JA3003 N电子秤(上海精密科学仪器有限公司);DK-600S型三用恒温水浴箱(上海精宏实验设备有限公司)。芹菜素购于陕西慧科植物开发有限公司，纯度98%，灌胃时用蒸馏水配成所需浓度。睾酮、雌二醇放射免疫分析药盒，JA3003N电子秤(上海精密科学仪器有限公司)，GC-1200γ放射免疫计数器。

1.3 分组与方法

将小鼠按体重随机分为4组:阴性对照组(生理盐水)、低剂量组(252 mg/L芹菜素)、中剂量组(504 mg/L芹菜素)和高剂量组(1008 mg/L芹菜素)，每组各30只。动物饲养在甘肃省中医学院中心实验室的SPF级实验室内。每天定时给阴性对照组0.01 mL/g bw生理盐水灌胃，各剂量组给予0.01 mL/g bw不同浓度的芹菜素灌胃，每天1次。连续灌胃7、14、21 d后分批小鼠内眦静脉丛取血后脱臼处死小鼠，所取血液放入离心管采用低速离心机(3000 rpm，5～6 min)，静置分层，吸取上层血清，采用放射免疫学方法(RIA)，利用GC-1200γ放射免疫计数器进行血清中睾酮(T)和雌二醇(E2)浓度的测定。分离附睾、睾丸，分别称重，计算脏器系数(脏器系数=脏器湿重/动物体重)。左侧附睾称重后立即放入盛有1 mL 0.86%的生理盐水平皿中，用眼科剪刀横向剪开3个切口，放置37℃水浴箱中，30 min后用微量移液器吸取10 μL精子悬液，应用WL JY-9000型伟力彩色精子质量检测系统(CASA)测定精子密度、活动率等指标。

1.4 统计学处理

2 实验结果

2.1 芹菜素对各组小鼠脏器系数的影响

经单因素方差分析，芹菜素7、14、21 d处理组，各剂量组睾丸系数、附睾系数与同期阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，由表1可见。

表1 芹菜素对小鼠睾丸、附睾系数的影响(n=10，±s)Table 1 Effect of apigenin on testis index and epididymis index(n=10，±s)

表1 芹菜素对小鼠睾丸、附睾系数的影响(n=10，±s)Table 1 Effect of apigenin on testis index and epididymis index(n=10，±s)

天数Days分组Group睾丸湿重Testis wet weight睾丸系数Testis index(×10-3)附睾湿重Epididymis wet weight附睾系数Epididymis index(×10-3)7 d 对照组Negative control 0.18±0.05 6.71±1.96 0.06±0.02 2.33±0.50低剂量组Low-dose group 0.18±0.04 6.79±1.31 0.07±0.02 2.55±0.63中剂量组Medium-dose group 0.19±0.05 7.30±1.95 0.07±0.01 2.73±0.56高剂量组High-dose group 0.20±0.05 8.05±1.51 0.07±0.02 2.91±1.04 14 d 对照组Negative control 0.21±0.03 5.88±0.96 0.08±0.02 2.25±0.54低剂量组Low-dose group 0.27±0.20 6.42±1.08 0.08±0.01 2.20±0.37中剂量组Medium-dose group 0.21±0.04 6.79±1.11 0.08±0.02 2.38±0.51高剂量组High-dose group 0.21±0.03 6.30±1.13 0.08±0.01 2.28±0.33

21 d 对照组Negative control 0.22±0.05 5.73±1.25 0.09±0.02 2.22±0.36低剂量组Low-dose group 0.24±0.05 6.00±1.04 0.10±0.02 2.36±0.54中剂量组Medium-dose group 0.23±0.03 5.84±1.04 0.09±0.02 2.22±0.42高剂量组High-dose group 0.22±0.04 5.36±0.86 0.09±0.02 2.25±0.50

2.2 芹菜素对小鼠血清性激素的影响

小鼠血清T浓度7 d无明显变化，14 d各剂量组均低于对照组(P=0.000)，高剂量组低于中剂量组和低剂量组(P＜0.05);21 d T浓度中、低剂量组都低于对照组(P＜0.05)。14 d小鼠血清T浓度随芹菜素浓度增加出现一定的剂量效应关系。小鼠血清E2浓度7、14、21 d各剂量组之间差异无统计学意义。E2/T 14 d高剂量组高于中、低剂量组和对照组(P＜0.05)。其变化与14 d血清T浓度高剂量组明显降低相一致。

表2 芹菜素对小鼠血清性激素的影响(n=10，±s)Table 2 Effect of apigenin on sex hormones(n=10，±s)

表2 芹菜素对小鼠血清性激素的影响(n=10，±s)Table 2 Effect of apigenin on sex hormones(n=10，±s)

注:与对照组比较 *P＜0.05;＊＊P ＜0.01;#:与低剂量组和中剂量组比较P ＜0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05;＊＊P ＜ 0.01;#:Compare with low-dose and medium-dose group P ＜ 0.05.

天数Days分组group T(ng/dl)E2(pg/mL) E2/T 7 d 对照组Negative control 10.57±4.85 7.64±3.24 0.67±0.29低剂量组Low-dose group 11.08±4.37 5.03±1.48 0.54±0.30中剂量组Medium-dose group 16.00±3.67 6.05±1.57 0.49±0.25高剂量组High-dose group 15.22±7.71 6.82±2.15 0.51±0.22 14 d 对照组Negative control 19.67±5.83 4.37±1.11 0.25±0.11低剂量组Low-dose group 12.69±6.18＊＊ 3.12±0.58 0.26±0.12中剂量组Medium-dose group 12.25±3.66＊＊ 5.39±1.49 0.35±0.09高剂量组High-dose group 7.61±1.46＊＊# 5.11±1.96 0.69±0.19*21 d 对照组Negative control 33.12±7.49 4.69±1.53 0.15±0.05低剂量组Low-dose group 19.36±8.37* 3.93±1.35 0.21±0.13中剂量组Medium-dose group 20.04±7.14* 2.63±1.41* 0.17±0.12高剂量组High-dose group 29.88±9.48 4.14±1.17 0.14±0.05

2.3 芹菜素对小鼠精子活动率的影响

14 d低、中、高剂量组的a级精子百分率低于同期阴性对照组，但差异无统计学意义。21 d低、中、高剂量组的a级精子百分率低于同期阴性对照组(P＜0.05)，表3。14、21 d各剂量组小鼠精子活力低于同期阴性对照组，但差异无统计学意义，表4。

表3 芹菜素对小鼠精子活动度影响(n=10，±s)Table 3 Impact of apigenin on mice sperm motility(n=10，±s)

表3 芹菜素对小鼠精子活动度影响(n=10，±s)Table 3 Impact of apigenin on mice sperm motility(n=10，±s)

天数Days分组Group n 精子运动状态分布Grade of sperm(%)a b c d 7 d 对照组Negative control 10 7.92±5.18 8.51±5.78 32.30±15.28 51.28±22.93低剂量组Low-dose group 10 8.25±4.09 9.38±4.18 28.53±12.89 53.84±14.58中剂量组Medium-dose group 10 13.62±7.80 14.47±9.50 42.91±12.74 29.00±11.87高剂量组High-dose group 10 8.63±6.56 10.94±5.13 34.55±14.56 45.88±16.17 14 d 对照组Negative control 10 8.56±3.98 11.82±3.88 32.97±8.21 46.65±9.80低剂量组Low-dose group 10 5.98±1.93 10.20±4.24 40.25±6.24 45.58±7.64中剂量组Medium-dose group 10 6.88±3.84 8.92±3.23 35.60±10.01 48.37±12.44高剂量组High-dose group 10 7.44±4.57 12.40±4.24 37.14±11.21 43.02±12.58

注:与阴性对照组比较，*:P﹤0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05.

2.4 芹菜素对小鼠精子密度的影响

7、14、21 d小鼠精子密度各剂量组与同期对照 组比较差异均无统计学意义，见表4。

表4 芹菜素对小鼠精子密度及活动率的影响(n=10，±s)Table 4 Effect of apigenin on sperm density and motility ratio(n=10，±s)

表4 芹菜素对小鼠精子密度及活动率的影响(n=10，±s)Table 4 Effect of apigenin on sperm density and motility ratio(n=10，±s)

天数Days分组Group精子密度(×10-9)Sperm density(×10-9)精子活力(a+b%)级Grade a+b(%)精子活率(a+b+c%)级Grade a+b+c(%)7 d 对照组Negative control 1.26±0.42 16.05±10.82 48.72±22.93低剂量组Low-dose group 1.37±0.76 17.63±6.82 46.16±14.58中剂量组Medium-dose group 1.16±0.98 28.09±16.04 71.00±11.87高剂量组High-dose group 1.31±1.07 24.19±14.24 54.12±16.17 14 d 对照组Negative control 3.18±1.17 20.38±5.98 53.35±9.80低剂量组Low-dose group 3.11±0.33 16.18±5.40 54.42±7.64中剂量组Medium-dose group 2.57±0.94 16.02±5.21 51.63±12.44高剂量组High-dose group 2.46±0.94 19.84±8.31 56.98±12.58 21 d 对照组Negative control 3.35±1.00 19.51±8.18 65.74±11.47低剂量组Low-dose group 3.34±0.81 15.30±5.39 59.28±12.77中剂量组Medium-dose group 2.88±0.55 17.34±5.65 64.11±14.39高剂量组High-dose group 2.84±0.73 15.84±3.96 55.96±9.60

3 讨论

目前，男性可采用的避孕和节育方法包括体外排精、阴茎套、安全期避孕法和输精管结扎术。虽然激素避孕成功用于女性已有40余年，但男性激素避孕的研究直到近年才有所发展［5，6］，但至今在世界范围内还没有一种成熟的、市场化的男性避孕药品。在传统避孕药的基础上，利用植物活性物质开发安全、有效的避孕药已经成为一种发展趋势。研究发现，芹菜素作为一种天然物质，对男性的精子的生成具有明显抑制作用［4］。本研究旨在针对芹菜素对精子质量影响的机制作进一步探讨，进一步开发芹菜素的药用价值。

脏器系数的变化可近似反映该脏器的功能状态和病变情况。本实验发现，芹菜素7、14、21 d各剂量组小鼠睾丸和附睾的脏器系数与阴性对照组比较无统计学意义，提示本实验剂量的芹菜素对小鼠睾丸和附睾无明显影响。

本次实验结果显示，连续给小鼠芹菜素灌胃14 d后，小鼠血清T浓度降低，并呈现一定的剂量反应关系，即随芹菜素剂量的增加，小鼠血清T浓度降低(P＜0.05)。21 d低、中剂量组低于对照组(P＜0.05)。提示随着芹菜素摄入量的增加，芹菜素对雄性小鼠睾酮的分泌具有明显抑制作用。而高浓度的雄性激素环境是精子产生的必要条件，与睾酮降低相一致，小鼠a级精子百分率21 d各剂量组均低于同期阴性对照组(P＜0.01)。14 d各剂量组也低于同期阴性对照组，但差异无统计学意义。提示芹菜素对小鼠睾酮有明显的降低作用，进一步影响小鼠精子的生成，特别是a级精子的生成，从而起到避孕的作用。并且从本次实验推测，睾酮的降低到影响精子的生成需要近7 d的周期。结合本实验的其他结果(精子运动参数)，推测芹菜素降低小鼠精子质量的作用主要是由于抑制了睾酮的生成。

Shivayogi P.等研究发现芹菜素对雌性大鼠有雌激素和抗雌激素样作用［7］，本次实验结果并未显示芹菜素对雄性小鼠血清E2含量产生明显的影响。

1 Noroozi M，Angerson WJ，Lean ME.Effects of flavonoids and vitamin C on oxidative DNA damage to human lymphocytes.Am J Clin Nutr，1998，67:1210-1218.

2 Prior RL，Cao G.Antioxidant capacity and polyphenolic components of teas:implications for altering in vivo antioxidant status.Proc Soc Exper Biol Med，1999，220:255-261.

3 Conney AH，Lu Y，Lou Y，et al.Inhibitory effect of green and black tea on tumor growth.Proc Soc Exper Biol Med，1999，220:229-233.

4 Gao JY(高金燕)，Chen HB(陈红兵).Research progress of active constituent in celery.Food Nutri China(中国食品与营养)，2005，7:29-31.

5 WHO task force on methods for the regulation of male fertility.Contraceptive efficacy testosterone-induced azoospermia in normal men.Lancet，1990，336:955-959.

6 Zhang RD(张仁东).Research progress of homone contraceptive methods in normal men.Chin J Family Plan(中国计划生育杂志)，2004，12:758-761.

7 Shivayogi P.Antifertility and hormonal properties of flavones of trigaoroban-chioide.Eur J Pharmacol，2000，391:193-197.