高效液相色谱法测定白色念珠菌细胞膜麦角甾醇的含量*

刘丽英，陈 虹，李雪青

(中国人民武装警察部队后勤学院，天津 300162)

近年来，真菌感染在免疫受损的病人群体中发病率迅速增加，其原因包括HIV感染、化疗引起的中性粒细胞减少、器官移植引起的免疫抑制、广谱抗生素的滥用以及激素的应用等。深部真菌感染已成为许多疾病的主要死亡原因之一［1］，而且真菌的耐药现象越来越严重。因此，研究抗真菌药物的作用机制，探究真菌耐药机理受到越来越多的医务工作者的重视。

影响真菌麦角甾醇生物合成和功能的药物一直是抗真菌药物研究的重点。临床应用最成功且仍作为一线药物而被广泛应用的酮康唑、氟康唑、特比萘芬等，都是以麦角甾醇为作用靶点，发挥其抗真菌作用［2］。本实验初步建立了采用高效液相色谱仪测定白色念珠菌中麦角甾醇含量的方法，以助于抗真菌药物的研究。

1 材料与方法

1.1 药物 PLAB(分子量432，乳白色粉末，难溶于水，纯度＞95%，由武警医学院生药学教研室提供)，DMSO配制，高压灭菌备用。

1.2 菌种 白色念珠菌C1a(中国医学真菌保藏中心)。

1.3 试剂 麦角甾醇标准品［2］(Sigma公司，批号23408194);甲醇(天津市康科德科技有限公司)、石油醚(天津市科锐思精细化工有限公司)为分析纯;酵母浸粉、胰蛋白胨、营养肉汤(北京奥博星生物技术责任有限公司)。

1.4 溶液及培养基配制 皂化剂为新鲜配制的含15%NaOH的95%乙醇溶液;YEPD培养基为10%酵母浸粉、20%胰蛋白胨、20%葡萄糖，溶于三蒸水中，高压灭菌后应用。

1.5 仪器 Millipore纯水仪(Millipore公司);HZQX100A 型恒温振荡培养箱;5000 μl、1000 μl加样枪(法国GILSON);METTLER AE 260(梅特勒－托利多仪器上海有限公司);SN－CS－2D单人净化工作台(苏州净化设备厂);低速离心机(北京医用离心机厂);电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司);P 1000 Thermo electron Corporation高效液相色谱仪(热电公司);N 2000色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所);CSF－1A超声发生器(上海超声波仪器厂);Phenomenex 色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);卧式矩形压力蒸汽灭菌器(上海华线医用核子仪器有限公司)。

1.6 方法

1.6.1 色谱分析条件 色谱柱:Phenomenex(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:100% 甲醇;流速:1.0 ml/min;检测波长:210 nm;柱温:室温;进样量:20 μl。

1.6.2 样品的制备

1.6.2.1 标准品溶液 精确称取麦角甾醇标准品0.0512 g，用流动相甲醇定容至20 ml，超声振荡溶解，并逐级倍比稀释配制成 1.08、0.54、0.27、0.135、0.068和0.039 mg/ml等系列浓度作为标准贮备液。

1.6.2.2 样品溶液 取白色念珠菌C1a接种于沙氏斜面，30℃培养2 d后接种于YEPD培养液中，30℃150 r/min振荡培养28 h，活化两次，使其处于对数生长期后期［3，4］。用 YEPD培养液调整真菌浓度至5×108cfu/ml。取此浓度菌液2 m1于250 m1锥形瓶中，加YEPD培养液98 ml，30℃ 150 r/min振荡培养28 h。200 r/min离心10 min，PBS洗涤两次至上清液无色，去上清液称各菌湿质量。精密称取湿菌0.5 g，加PBS 2.5 m1和皂化剂6 m1，混匀，80℃水浴皂化60 min。加石油醚(沸程30～60℃)6 ml提取3次，将提取液合并，加水6 ml洗涤，醚层于60℃水浴挥干即得未皂化脂(NSLs)，加甲醇使溶液体积为0.5 m1/g湿菌，－20℃保存，HPLC法测定其麦角甾醇含量。

2 结果

2.1 麦角甾醇标准品峰位的确定 在已建立的色谱条件下，麦角甾醇保留时间为11.698 min，采用面积归一化法按峰面积进行定量。标准品中麦角甾醇的色谱图见图1。

2.2 线性关系 将已经配制好的各浓度标准品，在已建立的色谱条件下进样20 μl，以进样浓度(X)为横坐标，相应的峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归。结果麦角甾醇在0.068～1.08 mg/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为 Y=8×106X+29 172(r=0.9989，n=3)。

2.3 精密度试验 以浓度为1.08 mg/ml的标准麦角甾醇为样品，进样20 μl，测定麦角甾醇的色谱峰峰面积，每4 h测一次，得日内精密度;以浓度为 0.54 mg/ml的标准麦角甾醇为样品，隔日测一次，得日间精密度，其RSD分别为4.58%和4.81%。

图1 麦角甾醇标准品HPLC色谱图

2.4 最低检测限 样品制备同标准曲线。当信噪比S/N＞3时，最低检测浓度为0.0025 mg/ml。

2.5 稳定性试验 以提取的样品溶液进行稳定性试验，连续进样3次，测得的麦角甾醇RSD为5.2%。样品中麦角甾醇的色谱图如图2。

图2 样品中麦角甾醇HPLC色谱图

2.6 加样回收试验 精密称取样品9份，每份0.1 g，分别加入浓度为1.08 mg/ml的标准品25、50和100 μl，每个浓度配制3份样品，混匀，作为供试品溶液，进样20 μl，结果见表1。平均回收率为79.93%，RSD 为5.44%。

2.7 样品测定 分别精密称取三个批次制得湿菌0.5 g，按照样品制备方法进行制备，注入高效液相色谱仪进行测定，测定结果见表2。结果白色念珠菌中麦角甾醇平均含量为(0.54 ±0.0720)μg/g。

表1 加样回收率测定结果

表2 白色念珠菌中麦角甾醇含量

3 讨论

真菌细胞膜为液态镶嵌模型，在排列成双层结构的磷脂中夹杂有大量的麦角甾醇类化合物，另外合成甘露聚糖、β－葡聚糖、几丁质等细胞壁组分所必须的酶也位于细胞膜上。麦角甾醇是真菌细胞膜的重要成分，在确保膜结构的完整性、膜的流动性、膜结合酶的活性、细胞活力以及物质运输等方面起着重要作用。麦角甾醇缺乏以及非平面甾醇前体累积会导致真菌膜的破裂［5］。因此临床上很多抗真菌药物主要通过抑制麦角甾醇的生物合成来达到抑菌效果［6］，如以两性霉素B为代表的多烯大环内酯类抗真菌药物可直接和细胞膜上的麦角甾醇结合，形成抗生素－甾醇复合物，破坏细胞膜的渗透性，以特比萘芬(terbinafine)为代表的烯丙胺类抗生素能抑制角鲨烯环氧化酶，引起角鲨烯在质膜上累积，造成膜的损坏。以往国内外学者多采用薄层扫描法、高效液相色谱法和气相色谱法等来测定土壤、植物和药品中麦角甾醇的含量［4，7－9］。薄层色谱虽然能够分离，但结果不直观，分离效果不理想，定量不准确;因甾醇类的沸点较高，直接用气相色谱法分析则存在拖尾后峰型展宽等问题;通过硅烷化、衍生化进行测定，方法比较烦琐。本实验建立了以HPLC仪来定量测定真菌中麦角甾醇含量的方法，该方法简便、快速、重复性好，为研究抗真菌药物的作用机制提供了有效的手段。

1 Mitchell T G，Perfect J R.Cryptococcosis in the era of AIDS－100 years after the discovery of Cryptococcas neoformans［J］.Clin Microbial Rev，1995，8(4):515

2 Kaufmanns C A，Carver P L.Antifungal agents in the 1990s［J］.Drugs，1997，53(4):539

3 刘丽英，刘涛，毕文超，等.白色念珠菌的生长曲线和世代时间测定［J］.武警医学院学报，2009，18(3):230

4 曹永兵，姜远英，殷明，等.薄层色谱扫描法检测氟康唑对真菌麦角固醇的影响［J］.第二军医大学学报，1999，20(4):312

5 Berg D，唐树人.抗真菌的甾醇生物合成抑制剂［J］.国外医药·合成药、生化药、制剂分册，1987，8(2):72

6 何秀萍，张博润.微生物麦角甾醇的研究进展［J］.微生物学通报，1995，25(3):166

7 郑力行，周晓瑜，施玮.高效液相色谱法测定室内屋尘麦角甾醇的含量［J］.复旦学报(医学版)，2005，32(6):691

8 孙国明，贾海英.HPLC测定暖宫胶囊中麦角甾醇含量［J］.中国中药杂志，2006，31(24):361

9 Thomas l，Jorgen A，Helle W R.Simplified and rapid method for extraction of ergosterol from natural samples and detection with quantitative and semiquantitative methods using thin － layer chromatography［J］.J Chromatogr A，2004，10(26):301