愈喘至圣膏微生物限度检查法验证

南京中医药大学泰州附属医院（225300）王威

愈喘至圣膏为医院制剂，是肺肾双补剂，其处方由28味中药组成[党参150g、熟地150g、陈皮100g、苏子100g、沙参100g、黄芪300g、麻黄100g、法半夏100g、白芥子100g、大贝母100g、白术100g、茯苓150g、胡桃肉150g、紫河车150g、五味子50g、干姜40g、百部100g、款冬花100g、紫苑100g、黄精150g、蛤蚧一对、当归100g、桃仁100g、杏仁100g、白果150g、红枣150g、生姜100g、淮山药150g]，适用于肺肾两虚，肾不纳气，痰浊蕴肺，肺气上逆症。症见：长期慢性咳喘，痰涎清稀，气短乏力，动辄尤甚，体虚自汗，易于感冒，形寒畏冷，腰膝酸软，甚则心悸胸闷，难以平卧，双下肢水肿，面色晄白，舌淡脉细等。通常认为愈喘至圣膏为中药补剂，应无抗菌作用，无须进行微生物限度检查方法验证，直接采用常规法检查即可。本文通过愈喘至圣膏微生物限度检查方法系统的方法验证实验，说明补药制剂其微生物限度检查方法同样需要验证。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品 愈喘至圣膏：膏剂，规格为2.8kg/付（泰州市中医院批号：121014，121121，121209）。

1.1.2 试验菌株 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（F）44 102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001] 、黑曲霉（Aspergillus ni-ger）[CMCC（F）98003]。

1.1.3 培养基 胆盐乳糖增菌液（批号：120407）、玫瑰红钠琼脂（批号：120105）、营养琼脂（批号：110704）、营养肉汤（批号：070410）、改良马丁（批号：070201）、改良马丁琼脂（批号：061225）。

1.1.4 仪器 试管，吸管，培养皿，0.45μm微孔滤膜，可重复使用的微孔过滤器，真空抽泵，滤瓶。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备[1]①取经37℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7，使成50～100CFU/ml，经活菌计数后备用。②取经25℃～28℃培养18～24h的白色念珠菌的改良马丁培养物1ml，用0.9%无菌氯化溶液10倍稀释至10-5～10-6，使成50～100CFU/ml，经活菌计数后备用。③取经25℃～28℃培养1周的黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液5ml洗下黑曲霉孢子，吸出孢子悬液1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释至与标准比浊管浊度相当的孢子悬液，取此孢子悬液1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释到10-4，使成50～100CFU/ml，经活菌计数后备用。

1.2.2 供试液制备 称取样品10g，加45℃pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液100ml，混匀，得1∶10供试液 。

1.2.3 培养基稀释法 取供试液1ml/皿（1∶200稀释），0.5ml/皿（1∶400稀释），0.2ml/皿（1∶1000稀释），分别与50～100CFU/ml的试验菌注皿，然后每皿加营养琼脂培养基15～20ml，摇匀，待凝固后，置规定温度培养24～72h，逐日观察结果。

附表1 培养基稀释法（1∶200）的回收率试验结果（%）

附表2 培养基稀释法（1∶400）的回收率试验结果（%）

附表3 培养基稀释法（1∶1000）的回收率试验结果（%）

附表4 薄膜过滤法的回收率试验结果（%）

1.2.4 薄膜过滤法[1]取静置片刻的供试液1ml，注入薄膜过滤器，加冲洗液每次50～100ml，冲洗3次，在最后一次冲洗液中加入50～100CFU/皿的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。滤干，取滤膜贴于相应琼脂平板上，置规定温度培养24～72h，逐日观察结果。

2 结果

细菌培养48h，逐日点计菌落数，以48h的菌落数报告；霉菌培养72h，逐日点计菌落数，以72h的菌落数报告[2][3]。菌回收率的计算[4]

常规法测定医院制剂愈喘至圣膏的回收率：用稀释法测定愈喘至圣膏的3个批次回收率见附表1～3。

附表1结果显示，供试品对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的生长有一定抑制作用，回收率为0～45%，均低于70%，故应加大培养基稀释级进行测定。

附表2结果显示，采用培养基稀释法（0.5ml/皿，1∶400），供试品对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的生长仍有一定抑制作用，回收率为0～62.5%，均低于70%，故应加大培养基稀释级进行测定。

附表3结果显示，采用培养基稀释法1∶1000，供试品对枯草芽孢杆菌回收率仍低于70%，故应进一步采用薄膜过滤法测定，结果见附表4。

附表4结果显示，采用薄膜过滤法供试品对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的生长回收率均高于70%，试验细菌正常生长。

3 讨论

中成药的微生物检查是保证药品质量及安全性重要的质控指标。《中国药典》2005年版增加了对药品进行微生物限度检查时，应通过微生物限度检查方法学验证的实验规定，以确保该品种检验方法的准确性，对提高药品质量有着重要意义 。

现有许多关于有抑菌作用的中成药、制剂微生物限度检查方法验证的试验报道，但对滋补中药制剂的微生物限度检查方法验证实验的情况尚无报道。有人认为，滋补中药制剂没有抑菌活性，无须进行方法学验证。笔者通过对3个批次愈喘至圣膏的方法验证研究发现，该制剂品种对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用，对白色念珠菌、黑曲霉则无抑菌作用。

愈喘至圣膏处方中某些药材炮制后可产生抑菌作用，如黄芪等。根据方法验证实验情况，在没有确切检查方法的时候愈喘至圣膏微生物限度细菌数检查建议采用薄膜过滤法进行测定较为稳妥。

总之，通过对3批愈喘至圣膏的验证试验，可得出以下结论：①愈喘至圣膏的细菌、霉菌和酵母菌计数方法学验证结果，不仅表明药典规定方法学验证的必要性，而且方法学验证的数据对评价药品质量提供了科学的依据；②本品进行细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证时，预实验选用金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌即可快速确定本品的微生物限度检查方法；③中药滋补剂不可简单作为不做验证试验的依据。