沙利度胺治疗裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的疗效观察

乔振国 沈佳庆 王超 叶建新 许春芳

·短篇论著·

沙利度胺治疗裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的疗效观察

乔振国 沈佳庆 王超 叶建新 许春芳

胰腺癌目前高居癌症死因的第4位[1]，诊断后中位生存期不到6个月，1年存活率约为12%，5年存活率<5%[2]。胰腺癌确诊时多属晚期，已失去手术机会，因此，针对胰腺癌的药物研究是目前的热点之一。沙利度胺(thalidomide，THD) 又名反应停，是谷氨酸的衍生物，具有抗实体肿瘤作用。体外实验研究证实[3]，沙利度胺可以抑制胰腺癌SW1990细胞的增殖，促进其凋亡。本研究采用腹腔内注射沙利度胺的方法治疗人胰腺癌SW1990细胞的裸鼠移植瘤，观察其对肿瘤生长及其对血管形成的作用，探讨其机制。

一、材料与方法

1．裸鼠胰腺癌移植瘤模型的建立及分组：Balb/c小鼠20只，4～5周龄，体重16～18 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。人胰腺癌SWl990细胞株由苏州大学附属第一医院血液研究所友情馈赠。取对数生长期的SW1990细胞，调整密度至1×107/ml。取0.2 ml细胞悬液注射于裸鼠的左前肢腋窝皮下，成瘤后按数字表法随机分成对照组、沙利度胺组(THD组)、吉西他滨组(GEM组)和联合(THD+GEM)组。THD组腹腔内注射THD 200 mg·kg-1·d-1，GEM组腹腔内注射GEM 50 mg·kg-1·d-1，联合组腹腔内同时注射THD及GEM，对照组腹腔内注射等容积生理盐水，均为每周3次，连续3周。种植后第4周颈椎脱位法处死荷瘤裸鼠，用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积(V)，V=a×b2/2。并称移植瘤重，计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100%。

2．VEGF mRNA检测：使用Trizol提取移植瘤组织总RNA，分光光度仪检测RNA纯度后采用RT-PCR法检测VEGF mRNA表达。VEGF序列上游为5′-GGACAGACAGACAGACACCG-3′，下游为5′-GCACCCAAGACAGCAGAAAG-3′，扩增片段560 bp；内参β-actin上游为5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游为5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′，扩增片段285 bp。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，摄片、扫描，以VEGF条带与内参条带灰度比值表示mRNA表达量。实验重复3次。

3．VEGF蛋白检测：取新鲜瘤组织，加入RIPA液提取组织总蛋白质，常规行蛋白质印迹法，以β-actin作为内参。鼠抗人VEGF抗体1∶200 稀释，最后ECL发光，暗盒曝光、显影和定影，用明基5000扫描仪扫描。以VEGF条带与内参条带灰度比值表示蛋白表达量。

4．移植瘤微血管密度(MVD)测定：采用免疫组化法检测，以CD34单抗为一抗，血管上皮被染成棕色，计数5个视野下的血管数，取均值。

二、结果

1．移植瘤体积、重量及抑瘤率：对照组、THD组、GEM组、联合组移植瘤体积分别为(1.256±0.128)、(0.898±0.142)、(0.720±0.124)、(0.442±0.117)cm3；抑瘤率分别为(28.3±3.2)%、(38.8±4.2)%、(63.7±6.0)%；瘤重分别为(1.412±0.138)、(1.013±0.096)、(0.864±0.112)、(0.512±0.091)g。THD组及GEM组瘤体积均较对照组减小，瘤重均较对照组降低(P值均<0.05)，联合组瘤体积及瘤重均较THD组及GEM组显著下降(P值均<0.05)。

2．移植瘤组织VEGF表达：对照组、THD组、GEM组、联合组移植瘤组织VEGF mRNA表达量分别为0.89±0.09、0.69±0.08、0.60±0.06、0.34±0.06；VEGF蛋白表达量分别为0.85±0.07、0.65±0.04、0.48±0.06、0.22±0.06。THD组及GEM组瘤组织的表达量均较对照组下降(P值均<0.05)，联合组瘤组织的表达又均较THD组及GEM组下降(P值均<0.05，图1、图2)。

图1对照组(a)、THD组(b)、GEM组(c)、联合组(d)移植瘤组织VEGF mRNA表达

图2对照组(a)、THD组(b)、GEM组(c)、联合组(d)移植瘤组织VEGF蛋白表达

3．移植瘤组织的MVD：对照组、THD组、GEM组、联合组移植瘤组织MVD分别为(22.11±3.07)、(15.65±2.54)、(16.97±2.26)、(11.04±2.44)个，THD组及GEM组瘤组织MVD均较对照组减少(P值均<0.05)，联合组瘤组织MVD又较THD组及GEM组减少(P值均<0.05，图3)。

图3对照组(a)、THD组(b)、GEM组(c)、联合组(d)移植瘤组织的CD34表达(免疫组化 ×400)

讨论实体肿瘤的生长及侵袭、转移有赖于血管的生成[4]。在诸多肿瘤血管生成因子中，VEGF是目前所知的作用最强的因子之一[5]。VEGF能促使内皮细胞分裂增殖，是具有高特异性的血管内皮细胞有丝分裂素，直接参与诱导肿瘤血管生成[6]，并在肿瘤血管生成的各个环节均有重要作用。而MVD与VEGF之间存在一定的关联性，被认为是判断肿瘤发展与转移能力的指标，是影响患者生存的独立预后因素[7]。因此，通过抑制肿瘤血管生成过程的任何环节将能阻断肿瘤血供，从而抑制肿瘤组织的发展、扩散和转移。

Jazieh等[12]应用THD联合吉西他滨处理非小细胞肺癌，发现联合用药不仅能提高疗效，且使用THD可减少吉西他滨的剂量以减轻不良反应。本结果发现，THD能抑制裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的生长，并使VEGF表达及MVD减少，这与文献结果相类似。本结果还发现，THD与吉西他滨的联合应用能更显著地抑制VEGF及MVD。因此，THD在实体肿瘤的治疗方面有一定应用前景，为胰腺癌的治疗研究指出了新的方向。但THD对各种肿瘤的疗效并不一致[13]，其抗肿瘤机制、抗瘤范围及应用条件等尚待进一步研究，其不良反应有待克服。

[1] Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2007.CA Cancer J Clin,2007,57:43-66.

[2] Jemal A,Murray T,Samuels A,et al.Cancer Statistics 2003.CA Cancer J Clin,2003,53:5-26.

[3] 沈阳，许春芳. 沙利度胺对人胰腺癌细胞株SW1990体外增殖及凋亡的影响.中华胰腺病杂志，2011，11:404-406.

[5] Okada K, Yokoyama K, Okihara K, et al.Immunohistochemical localization of Platelet-derived endothelial cell growth factor expression and its relation to angiogenesis in prostate.Urology,2001, 57:376-381.

[6] Coultas L,Chawengsaksophak K, Rossant J, et al. Endothelial cells and VEGF in vascular development.Nature,2005, 438, 937-945.

[7] Giatromanolaki A, Koukourakis MI, StathoPoulos GP, et al.Angiogenic interactions of vascular endothelial growth faetor, of thymidine phosphorylase, and of p53 protein expression in locally advanced gastric cancer.Oncol Res, 2000, 12:33-41.

[8] Downs LS Jr, Judson PL, Argenta PA, et al. A prospective randomized trial of thalidomide with topotecan compared with topotecan alone in women with recurrent epithelial ovarian careinoma.Cancer, 2008, 112:331-339.

[9] Figg WD,Li H,Sissung T,et al. Pre-clinical and clinical evaluation of estramustine, docetaxel and thalidomide combination in androgen-independent prostate cancer.BJU Int,2007,99:1047-1055.

[11] 徐晓晶，熊光苏，李恩林，等. 沙利度胺对人胰腺癌细胞细胞动力学和VEGF表达的影响.胃肠病学，2012，17:417-421.

[12] Jazieh AR, Komrokji R, Gupta A, et al. Phase Ⅱ trial of thalidomide, irinotecan and gemcitabine in chemonaive patients with advanced non-small cell lung cancer. Cancer Invest, 2009, 27:932-936.

[13] Gao S,Yang XJ,Zhang WG.et al.Mechanism of thalidomide to enhance cytotoxicity of temozolomide in U251-MG glioma cells in vitro.Chin Med J(Engl),2009,122:1260-1266.

2012-12-05)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.03.017

215006 苏州，苏州大学附属第一医院消化内科

许春芳，Email：xcf601@163.com