JAK/STAT通路对急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织TNF-α表达的影响

郝顺心 沈新明 吴瑞乔 王益 艾常华 严燕国 吴刚 张晶

·短篇论著·

JAK/STAT通路对急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织TNF-α表达的影响

郝顺心 沈新明 吴瑞乔 王益 艾常华 严燕国 吴刚 张晶

炎症递质在重症急性胰腺炎(SAP)发生、发展中具有重要作用，阻断炎症递质可降低SAP的严重程度并提高SAP的治疗效果。JAK/STAT通路与SAP的发生和发展密切相关，它直接参与细胞因子受体-细胞因子诱导的基因转录。TNF-α是一种强有力的促炎细胞因子，在SAP的发生和发展中起着重要作用。本研究旨在探讨SAP时JAK/STAT通路对胰腺组织TNF-α表达的影响及意义。

一、材料与方法

1．动物分组和模型制作：SPF级雄性Wistar大鼠54只由湖北省疾病预防控制中心提供，体重200～250 g。按随机表法分为假手术组、急性坏死性胰腺炎(acute pancreatitis necrotizing, ANP)组、JAK抑制剂AG490处理组(AG490组)，每组18只。采用胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠(Sigma公司)溶液1 ml/kg体重的方法制备ANP模型。假手术组胆胰管内注入等容积生理盐水。AG490组在造模前30 min皮下注射AG490(Selleck公司)8 mg/kg体重。术后3、6、12 h分批剖杀大鼠，心脏采血，分离血清，置-20℃保存；取胰头部胰腺组织，用4%多聚甲醛固定，其余胰腺组织经液氮速冻后置-80℃冰箱保存。

2．血清淀粉酶活性检测：采用全自动生化分析仪测定。

3．胰腺病理学检查：取固定的胰腺组织，常规石蜡包埋、切片、HE染色，按Schmidt等[1]标准进行病理评分。

4．胰腺组织TNF-α mRNA表达的检测：取100 mg冻存的胰腺组织，应用Trizol抽提总RNA，应用第一链cDNA合成试剂盒(MBI公司)逆转录成cDNA，应用PCR试剂盒(MBI公司)进行扩增。引物序列：TNF-α(326 bp)上游为5′-CATGTACCTGGGAGGAGTCT-3′，下游为5′-CTTCAGCAT-CTCGTGTGTTT-3′；内参β-actin(207 bp)上游为5′-CCA-ACTGGGACGATATGGAG-3′，下游为5′-CAGAGGCAT-ACAGGGACAAC-3′。引物由美国Invitrogen公司设计合成。PCR反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、56℃(TNF-α)或54℃ (β-actin)30 s、72℃ 1 min， 35个循环，72℃ 7 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像系统扫描分析，以TNF-α与β-actin条带灰度比值表示mRNA的表达水平。

二、结果

1．血淀粉酶的变化：假手术组大鼠血清淀粉酶活性在正常范围；ANP组大鼠血清淀粉酶活性较假手术组显著增高，且随着时间推移活性逐渐升高； AG490组大鼠血清淀粉酶活性较ANP组显著下降，但仍显著高于假手术组(表1)。

表1 3组大鼠血清淀粉酶活性变化

注：与假手术组比较，aP<0.01；与ANP组比较，bP<0.01

2．胰腺组织病理学改变：假手术组大鼠胰腺呈淡粉红色，光泽度好；镜下见胰腺小叶结构完整，间质清晰。ANP组大鼠3 h时胰腺水肿明显，十二指肠区囊肿样变，胆胰管周围见斑片状出血，小肠系膜可见白色皂化点，12 h见胰腺重度水肿，呈囊肿样变，出血坏死范围明显扩大，后腹膜、肾前筋膜和肠系膜可见明显的皂化区，胃极度扩张，腹腔大量血性腹水；3 h时镜下见胰腺腺泡水肿，区域性坏死、脂肪液化坏死和出血，炎症细胞浸润，12 h见胰腺破坏更加广泛和严重，腺泡结构大量消失，残存的胰腺小叶孤立于广泛的坏死区，广泛脂肪液化坏死和出血，大量炎症细胞浸润。AG490组大鼠肉眼观胰腺病变程度较ANP组减轻，后腹膜、肾前筋膜和肠系膜皂化区范围较ANP组缩小；3 h时镜下见胰腺腺泡水肿，少量坏死区，炎症细胞浸润，且随时间延长逐渐加重，但较同时间点ANP组明显减轻(图1)。ANP组的胰腺病理评分较假手术组显著升高，AG490组较ANP组显著下降，但仍显著高于假手术组(表2)。

图1假手术组(a)、ANP组(b)、AG490组(c)大鼠12 h时胰腺大体(上)及组织病理学(下)改变(HE ×100)

表2 3组大鼠各时间点胰腺组织病理评分

注：与假手术组比较，aP<0.01；与ANP组比较，bP<0.05，cP<0.01

3．胰腺组织TNF-α mRNA表达的变化：假手术组大鼠胰腺组织TNF-α mRNA低表达。ANP组大鼠胰腺组织TNF α mRNA表达增强，6 h时达高峰，表达量显著高于假手术组。AG490组大鼠胰腺组织TNF-α mRNA表达显著低于ANP组，但仍显著高于假手术组(表3，图2)。

表3 3组大鼠各时间点TNF-α mRNA表达

注：与假手术组比较，aP<0.01；与ANP组比较，bP<0.01

图2 各组大鼠胰腺组织TNF-αmRNA的表达

讨论在众多炎症递质中，TNF-α是SAP中最早升高的细胞因子，作为始发因子激发一系列的级联反应，诱导IL-6、IL-8及TNF-α自身等因子的产生[2-3]，参与多器官功能不全的发生。TNF-α也是损伤远处脏器的重要因子，其水平与SAP的严重程度、病死率和患者预后呈明显正相关。Oruc等[4]用抗TNF-α单抗infliximab预处理急性胰腺炎大鼠，结果明显降低急性水肿型胰腺炎大鼠的血清淀粉酶活性及胰腺病理损伤，抑制中性粒细胞浸润及胰腺组织的髓过氧化物酶活性。

JAK-STAT通路是在研究干扰素( IFN-α, IFN-γ) 对培养细胞基因转录的诱导作用中发现的一条新的细胞信号转导通路[5]。JAK是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶(PTK)，既能催化与之相连的细胞因子受体发生酪氨酸磷酸化，又能磷酸化多种含特定SH2区的信号分子从而使其激活。STATs是JAKs磷酸化作用的底物，能将信号直接传递到核内，调节特定基因的表达。JAK-STAT通路的信号传递过程为细胞因子与其受体结合后引起受体分子的二聚化，使得与受体耦联的JAK相互接近并通过相互的酪氨酸磷酸化而活化，活化的JAKs催化受体本身的酪氨酸磷酸化，并形成相应的STATs结合位点，使STATs通过SH2功能区与受体结合，并在JAKs的作用下实现其磷酸化而活化，然后STATs形成同或异二聚体并进入核内，与相应的靶基因启动子结合而激活相应的基因转录和表达。

JAK-STAT信号转导通路不仅在细胞的增殖、分化、凋亡和血管发生等正常生理过程中起着重要的作用，亦与某些疾病的发生和发展密切相关。该通路的异常激活会导致不同的病理过程，而抑制该通路的活化能减轻疾病的病理损伤[6]。Gallmeier等[7]研究发现胰腺腺泡细胞内存在JAK-STAT信号转导通路，能对干扰素介导的急性胰腺炎作出反应。Robinson等[8]证实，TNF-α刺激胰腺腺泡细胞后，IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α等细胞因子生成明显增多，而用PYY减少STAT与反应元件的结合后，上述细胞因子生成明显减少。因此，推测JAK-STAT信号通路可能在基因水平上调节TNF-α的表达，其在SAP中的作用可能与核因子-κB(NF-κB)相似。AG490是酪氨酸激酶抑制剂，是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，结构类似酪氨酸，可以和受体酪氨酸激酶竞争结合位置，特异性抑制JAK，有效阻断其下游的STATs活化。 JAK-STAT通路的活化能促进ANP大鼠TNF-α的合成，加重胰腺的病理损伤[9]。本研究结果表明，ANP大鼠胰腺组织TNF-α mRNA的表达明显增强，而使用AG490后TNF-α mRNA的表达明显降低，说明抑制JAK-STAT通路的活化可以抑制TNF-α的合成，减轻胰腺的病理损伤，对ANP大鼠起到保护作用，为临床治疗SAP提供一个新的思路及实验依据。

[1] Schmidt J，Rattner DW，Lewandrowski K，et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.Ann Surg，1992，215: 44-56.

[2] Norman J, Franz M, Messina J, et al. Interleukin-1 receptor antagonist decreases severity of experimental acute pancreatitis. Surgery, 1995,117:648-655.

[3] 毛恩强, 汤耀卿, 张圣道,等. 重症胰腺炎感染期TNF-α的变化及对器官功能的影响. 中华肝胆外科杂志, 2002,8:97-99.

[4] Oruc N, Ozutemiz AO, Yukselen V, et al. Infliximab: a new therapeutic agent in acute pancreatitis? Pancreas, 2004,28:e1-e8.

[5] Darnell JE Jr，Kerr IM，Stark GR.Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins.Science，1994，264: 1415-1421.

[6] Huang Y，Cen LP，Choy KW，et al.JAK/STAT pathway mediates retinal ganglion cell survival after acute ocular hypertension but not under normal conditions.Exp Eye Res，2007，85: 684-695.

[7] Gallmeier E，Schäfer C，Moubarak P，et al. JAK and STAT proteins are expressed and activated by IFN-gamma in rat pancreatic acinar cells. J Cell Physiol，2005，203: 209-216.

[8] Robinson K，Vona-Davis L，Riggs D，et al. Peptide YY attenuates STAT1 and STAT3 activation induced by TNF-alpha in acinar cell line AR42J. J Am Coll Surg，2006，202: 788-796.

[9] 郝顺心, 王卫星, 陈辰,等. 罗格列酮对重症急性胰腺炎大鼠胰腺组织STAT1的影响. 中华外科杂志, 2009,47:218-221.

2012-12-05)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.03.016

430064 湖北武汉，武汉科技大学附属天佑医院普外科

郝顺心，Email:pjcps@126.com