胚胎致死性异常视觉蛋白HuR在卵巢上皮性癌表达及预后

齐玉明 成艳梅 王振芬 李研 石彬

卵巢恶性肿瘤在女性生殖器官恶性肿瘤中的发生率占第三位，但其病死率却居第一位。卵巢癌发病隐匿，70%的患者诊断明确时已是临床晚期。虽然，多年来外科手术操作技术、化疗方案不断改进，仍不能改善卵巢癌的生存率，5年生存率始终徘徊在30%左右。因此，寻找新的防治方法，提高患者5年的生存率是急需解决的问题。HuR是RNA结合蛋白中胚胎致死异常视觉(embryonic lethal abnormal vision，ELAV)家族的一员，ELAV家族是最紧密的RNA结合蛋白。HuR广泛存在于几乎所有的增殖细胞中，通过一定的信号途径参与细胞的增殖、分化等多种细胞行为的调节。人体内有多种细胞可分泌HuR，但在一些正常组织中表达水平很低，而在许多恶性肿瘤组织中表达水平增高，且与预后不良有关。本研究旨在检测HuR在卵巢上皮性癌的表达，对卵巢癌的防治提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2005年6月至2010年8月，在河北医科大学第二学院妇科因卵巢上皮性癌而接受手术治疗的患者68例，术前均未接受放疗、化疗、激素及免疫治疗，术后病理组织学诊断明确，平均年龄52岁。按照WHO(1973)标准将研究对象进行组织学分类及分级，其中包括浆液性囊腺癌44例，黏液性囊腺癌18例，子宫内膜癌6例;病理分级：高分化10例，中分化30例，低分化28例;有淋巴结转移者30例，无淋巴结转移者38例;按照2000年FIGO临床分期标准，其中Ⅰ期11例，Ⅱ期16例，Ⅲ期31例，Ⅳ期10例;选择同期交界性卵巢肿瘤10例(浆液性6例和黏液性4例)和同期因其他原因行子宫+双附件切除的正常卵巢5例。

1.2 方法

1.2.1 标本采集：肿瘤切下后，从肿瘤生长活跃、无坏死的边缘部位取下约1 cm3大小的组织2块，放入100 mmol/L甲醛溶液固定、石蜡包埋，用于免疫组化测定。

1.2.2 免疫组化法检测HuR的表达：标本常规脱水，石蜡包埋并制成4μm厚的连续切片，经HE染色判断切片质量后，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法，在同一时间、同一条件下进行免疫组化检测。兔抗人多克隆HuR抗体为Santa Cruz产品，兔SP免疫组化试剂盒、DAB试剂盒均购于北京中杉金桥试剂公司。染色步骤按SP试剂盒(北京中杉金桥试剂公司)说明书进行，微波修复抗原，一抗滴度为1∶200。磷酸盐缓冲液(PBS)溶液代替一抗做阴性对照。取表达最强的部分，按着色程度分为基本未着色，染色与背景相似者为0分;着色浅，高于背景为1分;中度着色，明显高于背景者为2分;强染，着色深棕黄色者为3分。随机选取5个高倍视野，在400倍视野下连续记数100个细胞，阳性细胞数小于5%者为0，阳性细胞数5% ～25%计1分;26% ～50%计2分;51% ～75%计3分;76% ～100%计4分，两种积分相加，积分为0～1分，表示阴性(-);积分为2～3分，表示阳性(+);积分为4～5分，表示阳性(++);积分为6～7分，表示阳性(+++)。

1.3 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计数资料比较采用χ2检验，等级资料的组间比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢肿瘤和正常卵巢组织胞核中的表达 卵巢上皮性癌组织中胞核HuR的表达明显高于交界性卵巢肿瘤和正常卵巢组织(P＜0.01);交界性卵巢肿瘤胞核HuR的表达与正常卵巢组织比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

表1 3组HuR阳性表达率比较 例

2.2 胞质HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中的表达 卵巢上皮性癌组织中胞质HuR的表达明显高于交界性卵巢肿瘤和正常卵巢组织(P＜0.05);胞质HuR的表达在交界性卵巢肿瘤与正常卵巢组织比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表2。

表2 3组胞质HuR阳性表达率比较 例

2.3 胞质HuR的表达与卵巢上皮性癌临床病理学特征的关系 FIGO的临床分期Ⅲ～Ⅳ期胞质HuR的阳性表达率显著高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.05)。组织分化高的卵巢上皮性癌胞质HuR的表达较中、低分化的表达弱(P＜0.05)，胞质HuR的表达在中分化与低分化之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 胞质HuR的表达与卵巢上皮性癌临床病理学特征例(%)

3 讨论

3.1 HuR在卵巢上皮性癌中表达的意义 HuR是RNA结合蛋白中胚胎致死异常视觉(embryonic lethal abnormal vision，ELAV)家庭的一员，又称为类胚胎致死异常视觉蛋白 A。ELAV家庭是最紧密的RNA结合蛋白，最初是在果蝇中被发现。ELAV家庭共包括四个成员：HuD、HuC、Hel-N1(HuB)和HuR。HuR几乎在所有增殖的细胞中表达，而其他三个成员主要表达在终端分化的神经组织中。

HuR分子量为36 kD，许多早期反应基因的mRNAs在其3’非翻译区(untranslated regins，UTR)有AU富含元件(AU-rich elements，AREs)，可以与顺式反应元件一起调节mRNAs的不稳定性。HuR可以与 AREs相互作用，AREs在调节细胞生长和分化以及免疫应答基因的表达中起关键作用，编码细胞因子、淋巴因子及原癌基因的一类早期反应基因的mRNA均含有ARE，其mRNA通常在细胞外刺激的条件下短期转录，然后被迅速从细胞质清除。这类基因通常是即刻进行转录，与RNA结合蛋白结合的这种基因表达调控步骤，对于精确调控潜在有害的致炎因子和转化因子有重要作用。目前，许多ARE结合蛋白被识别，HuR是其中一种。Nowotarski等［1］报道HuR的过表达不是增强mRNA降解，而是在瞬时转染实验中稳定mRNA。并且在转染哺乳动物细胞后稳定包含AREs的mRNAs并使之过表达。本研究发现，HuR即可在胞核表达，也可在胞质表达。胞核HuR的表达在正常卵巢组织、交界性卵巢肿瘤组织和卵巢上皮性癌中阳性表达率呈递增趋势，且在卵巢上皮性癌中的表达明显高于交界性卵巢肿瘤和正常卵巢组织，而在交界性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中表达差异无统计学意义(P＞0.05)。胞质HuR的表达在正常卵巢组织、交界性卵巢肿瘤组织和卵巢上皮性癌中阳性表达率也呈递增趋势，且卵巢上皮性癌中的表达与交界性卵巢肿瘤和正常卵巢组织比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而在交界性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中表达差异无统计学意义。提示，HuR的异常表达与卵巢癌的发生有密切关系。

3.2 HuR在胞质和胞核的表达及与临床指标的关系 近来研究表明HuR可以在核质间穿梭［2］。Hu蛋白含有3个保守的RNA识别模序(RNA recognition motifs，RRMs)，在 RRM2 和RRM3之间有铰链区，该区内含一段包含52个氨基酸的HuR核质穿梭(HuR nucleocytoplasmic shuttling，HNS)区，对细胞定位和功能相当重要。可以先与包含ARE的mRNAs在细胞核内结合，然后与之一起进入细胞质，保护mRNAs避免其衰变降解，从而导致HuR在多种恶性肿瘤中表达上调。Jie等［3］研究表明HuR可以通过2种不同途径进入细胞质。一种是需要4种蛋白配体(PP32，SETa，SETb和APRL)的依赖染色体区域维持蛋白质(chromosomal region maintenance protein1，CRM1)，另一种是非依赖CRM1而需要HNS，正是通过上述两种机制，使HuR在核与质间穿梭，从而使HuR在胞核与胞质均有表达。但是，许多研究发现胞质HuR的表达与临床病理参数和预后有关，未发现胞核HuR的表达与临床病理参数和预后有关［4］。

本研究选择了与卵巢上皮性癌关系最密切的五个临床参数，分别是患者年龄、FIGO分期、病理类型、组织学分级和淋巴结转移。研究结果显示，胞质HuR的表达与肿瘤的组织学分级和临床分期有关。胞质HuR在组织学分级1级(高分化)、2级(中分化)、3级(低分化)的阳性表达率分别为：10.00%、46.67%、57.14%，呈递增趋势，组织分化高的卵巢上皮性癌组织中胞质HuR的表达同中-低分化组的表达比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。FIGO临床分期晚期(Ⅲ+Ⅳ期)患者胞质HuR的阳性表达率(56.09%)显著高于早期(Ⅰ+Ⅱ期)患者(29.63%)，差异有统计学意义(P＜0.05)。本研究未发现胞核HuR的表达与临床病理参数存在相关性。这与Erkinheimo等［5］报道的结果基本一致。作为 mRNA稳定因子的HuR蛋白在肿瘤细胞的胞质分布有其特殊的意义。推测胞质HuR的分布与肿瘤的发生发展有关。对于其胞质分布的机制，有待进一步的研究。提示恶性程度越高，临床分期越晚，卵巢癌组织中胞质HuR的表达越强。

本研究未发现胞质HuR的表达与患者发病年龄与病理类型和淋巴结转移有关。这与有的学者报道不相同。Denkert等［6］报道胞质HuR的表达与卵巢癌年龄有关，与病理类型和淋巴结转移无关。Mrena等［7］报道，胞质HuR的表达与胃癌的发病年龄、性别和淋巴结转移有关。可能与胞质HuR在不同肿瘤细胞分布不同和本实验中样本例数相对较少，造成实验误差有关，有待于增加样本例数，改进实验方法进一步证实。

已发现许多基因的mRNA可以与HuR结合，例如：COX-2、血管源性生长因子(如VEGF)、和免疫抑制细胞因子(如TGF、IL-6)等，均可促进肿瘤生长［8］。Grau 等［9］报道，在中枢神经系统(CNS)肿瘤中，血管内皮生长因子(VEGF)RNA转录子的稳定对于其表达上调是一种重要的分子途经，而HuR对上述基因具有转录后调控作用。提示，如果成功抑制HuR对上述基因的转录后调控作用，有可能抑制肿瘤的生长与转移。

根据HuR蛋白在恶性肿瘤中的过表达和它的生物学功能，HuR蛋白抑制剂可对抗肿瘤致炎因子血管生成和肿瘤增殖，推测HuR抑制剂有望成为肿瘤分子治疗的新靶点。目前，抑制HuR的RNA介导的治疗已用于临床［10］，我们期待在这一领域的研究能够更加深入。

1 Nowotarski SL，Shantz LM.Cytoplasmic accumulation of the RNA binding protein HuR stabilizes the ornithine decarbo-xylase transcript in a murine non-melanoma skin cancer model.JBiol Chem，2010，8：1074.

2 Kim HH，Abdelmohsen K，Ashish Lal，et al.Nuclear HuR a-ccumulation through phosphorylation by Cdk1.Genes ＆ Dev，2008，22：1804-1815.

3 Jie Yi，Na Chang，Xinwen Liu，et al.Reduced nuclear export of HuR mRNA by HuR is linked to the loss of HuR in replicative senescence.Nucleic Acids Res，2010，38：1547-1558.

4 Heinonen M，Bono P，Narko K，et al.Cytoplasmic HuR expression is a prognostic factor in invasive ductal breast carcinoma.Cancer Res，2005，65：2157-2161.

5 Erkinheimo TL，Lassus H，Sivula A，et al.Cytoplasmic HuR expression correlates with poor outcome and with cyclooxygenase-2 expression in serous ovarian carcinoma.Cancer Res，2003，63：7591-7594.

6 Denkert C，Weichert W，Pest S，et al.Overexpression of the embryonic-lethal abnormal vision like protein HuR ovarian cancinoma is a prognostic factor and is associated with increased cyclooxygenase-2 expression.Cancer Res，2004，64：189-195.

7 Mrena J，Wiksten A，Thiek A，et al.Cyclooxygenase-2 is an independent prognostic factor in gastric cancer and its expression is regulated by the messenger RNA stability factor HuR.Clin Cancer Res，2005，11：7362-7368.

8 Anke D，El-Sayed A，Andrea H，et al.Posttranslational Modification of the AU-Rich Element Binding Protein HuR by Protein Kinase C Elicits Angiotensin II-Induced Stabilization and Nuclear Export of Cyclooxygenase 2 mRNA.Mol Cell Biol，2008，28：2608-2625.

9 Grau SJ，Trillsch F，Herms J，et al.Expression of VEGFR3 in glioma endothelium correlates with tumor grade.J Neuro Oncol，2007，82：141-150.

10 Giessen K，Di-Marco S，Clair E，et al.RNA-mediated HuR depletion leads to the inhibition of muscle cell differentiation.JBiol Chem，2003，47：47119-47128.